A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Screeningpeptider som aktiverar MRGPRX2 med hjälp av konstruerade HEK-celler
Chapters
Summary November 6th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Tekniker för att generera ett bibliotek med korta peptider som kan aktivera mastceller via MRGPRX2-receptorn beskrivs. Associerade tekniker är enkla, billiga och kan utökas till andra cellreceptorer.
Transcript
Idag kommer vi att demonstrera en metod för att screena ett peptidbibliotek, mot en nyligen upptäckt huvudreceptor, som är Mas-relaterad G-proteinreceptor X2, även känd som MRGPRX2-receptor. Mastceller är en integrerad del av immunsystemet och spelar en avgörande roll i både medfödda och adaptiva immunsvar. Mastceller aktiveras antingen av den antigenbundna Fc epsilon R1-receptorn eller av den nyligen upptäckta X2-receptorn.
Aktivering av ytbunden X2-receptor, har kopplats till flera immunologiska och inflammaterade sjukdomar och därför är det viktigt att förstå bindningsmekanismen för denna receptor till dess ligander. För att göra det har vi utvecklat ett bibliotek med små peptidmolekyler och har screenat dem mot X2-receptorer överp uttryckta på hexi. I studien konstruerades ett peptidbibliotek med enkla och mångsidiga tekniker för alaninskanning och aminosyra trunkeringar.
Heck293 säger, uttrycker X2-receptorer när de aktiveras med peptiderna och bred typ hexi användes som kontroll. I trunkering frisättning vid aktivering övervakades för att studera den X2-baserade aktivering. Experimentellt är Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye upphetsad på 340 och 380 nanometer, medan utsläppet registreras vid 510 nanometer.
Vid kalciumbindning ökar fluorescensintensiteten vid 340, medan den på 380 nanometer minskar. Färgämnet deponeras sedan vid förhållandet mellan fluorescensintensiteten vid 340, till 380 nanometer. 340 av ett 380-förhållande står i proportion till det intracellulära kalciumet, värdet på det, kan beräknas, enligt Grynkiewicz-ekvationen.
Tabbningsförhållandet mellan två fluorescensintensiteter, effekten av experimentella faktorer som utspädning, fotobleaching, färgläckage och dofttäthet detekteras. Så, utan ytterligare dröjsmål, låt oss starta experimentet. För att identifiera liganderna i mastcellen MRGPR X2-receptorn, generator N-trunkerad, C-trunkerad och N +C-trunkerad peptidbibliotek, genom att trunkera N-terminal, C-terminal och N +C-terminal aminosyror av pam-12 misproctivity.
Använd peptidsyntesen i fast fas för att syntetisera peptiderna. Ändra slutterminalen till en inställd tidvattengrupp och C-terminal till mittgrupp. Generera och alaniner kan peptidbibliotek, genom att ersätta respektive aminosyror av pam-12 av Alanine, en i taget.
Ändra slutterminalen till en setidegrupp och C-terminalen till mittgruppen. Förbered odlingsmediet genom att komplettera dmem med hög glukos, med 10% fetala nötkreatursserum, två millimolar L-glutamin, hundra enheter per ml penicillin och hundra mikrogram, per ml av en streptomycin. Förutom cellerna i tee sue kultur drag, 375 kulturkolv vid 37 grader Celsius, 5%CO2, tills de är 75 till 80% konfluenta.
När 75% konfluent, tvätta cellerna och tillsätt två till tre ml Proof-C, för att lossa cellerna. När cellerna har lossnat samlar du cellerna i Proof-C. Tillsätt sex till nio ml färskt medium.
Centrifug cellerna på 1620g i tre till fem minuter. Efter centrifugation, kassera supernatanten för att samla pelleten. Återanvänd cellerna i färskt odlingsmedium.
Späd cellerna enligt önskad koncentration. Vid 200 mikroliter av cellupphängningen med koncentrationen av 200 000 celler häller du ambon i varje brunn för att söka 40 000 celler per brunn. Skydda cellerna i 24 timmar i 37 grader Celsius, 5%CO2 inkubator.
Använd Fura-2 AM färgämne för experimentet. Tillsätt 50 mikroliter DMSO i 50 mikrogram Fura-2 AM för att förbereda en millimolär stark lösning av Fura-2 AM färgämne. Tillsätt en mikroliter av ett millimolärt Fura-2 AM-färgämne per ml färskt medium för att förbereda utspädningsmediet för en mikromolekylfärgkoncentration.
Ta bort 96-brunnsplattan från inkubatorn och kassera mediet. Ersätt mediet med färskt utspädningsmedium. Tillsätt 200 mikroliter utspädningsmedium i varje brunn.
Inkubera cellerna i 30-40 minuter i 37 grader Celsius, 5% CO2 inkubator. Medan cellerna inkuberas ställer du in plåtläsaren. Ställ in temperaturen på 37 grader Celsius.
Välj Flex i inställningar. Ställ in läsläget på Fluorescens och Nederkantsläsning. I Våglängder, ställ in antalet våglängder till två.
Ställ in excitationen på 340 nanometer och 380 nanometer. Ställ in utsläppet på 510 nanometer. Lämna känsligheten till Standard.
Ställ in intervallet på 3,9 sekunder i Tidsinställning. Ställ in körtid på 94 sekunder för att få 25 nummer av läsningar. Välj sedan typen Analysplatta.
Välj sedan De brunnar som ska läsas. I Compound Transfer ställer du in överföringar till en och Initial Volym till hundra mikroliter. Ställ in pipetthöjden på hundra mikroliter, Volym till 50 mikroliter och Tidspunkt till 36 sekunder för att lägga till föreningen och för att sköta avläsningen.
Välj sedan typen Sammansatt källa. Låt Triturate inte användas. Välj layouten Tips och pipetttips.
För sammansatta och spetspelare överförs föreningen i kolumn ett av den sammansatta plattan. Ställ in tipskolumnen på en och Sammansatt kolumn till en. Lämna Autocalibrate till On.Click OK. Efter 40 minuters inkubation, ta bort mediet.
Tvätta cellerna med XDB-bufferten. Tillsätt hundra mikroliter XDB-buffert för fluorescensavläsning. Ta plattan för fluorescensavläsning.
När pritchett har nått 37 grader Celsius, tryck på läskammaren för att sätta analysplattan i fluorescensplattans läsare. Tryck på källan för att sätta den sammansatta plattan. Förbered den sammansatta plattan genom att tillsätta 200 mikroliter respekterade peptider ionomysin och EGTA för att vända X-lösningar.
Tryck på spetssprutan för att lägga tipsboxen. Använd svart spets för att undvika automatisk stötdrålning. När plattorna har förvarats, och om du använder programvarans inställningar och trycker på Läs.
Bestäm kalciumkoncentrationen från fluorescensförhållandet enligt Grynkiewicz-ekvationen. Visas är fluorescensdata för pam bra peptid. Som man kan se, efter peptidtillskott på 36 sekunder, fluorescens vid 340 nanometer som är ljumna ökningar med 380 nanometer rekordminskningar.
Data representeras som förhållandet mellan 340 och 380 signaler. De visar att signalerna ökar efter peptidtillskott. Denna siffra är de representativa uppgifterna för en aktiverande peptid.
Figur A visar fluorescenssignalerna för en aktiverande peptid. Representiva data motsvarar cram12 Peptid lades till efter att ha skapat en baslinje för anbudscykler, vilket framgår av ado. Figur B visar förhållandet mellan fluorescensutsläpp efter excitation vid 340 nanometer, med fluorescensutsläpp efter excitation vid 380 nanometer.
Denna siffra är representativa uppgifter för det tomma. Bild A visar fluorescenssignalerna för blindprovet. HTB tillsattes efter utspädning av en baslinje för 10 utfodringscykler, vilket framgår av ado.
Figur B visar ransonen av fluorescensutsläpp efter excitation vid 340 nanometer till florescence-utsläpp efter excitation vid 380 nanometer. Denna siffra är representativa data för standarderna för färgkalibrering. Figur A visar att jonomycin lades till vid de 10: e avläsningarna, vilket visas av ado för att få maximal fluorescens i cashem-bundet tillstånd.
EGPA Triton X hundra lades till efter 20 avläsningar som visas av ado som får minsta signal. Figur B visar förhållandet mellan fluorescensutsläpp efter excitation vid 340 nanometer med fluorescensutsläpp efter excitation vid 380 nanometer. Dessa värden sätts vidare i Grynkiewicz-ekvationen för att få koncentrationens intracellulära cache.
Denna siffra visar karakteriseringen av en representativ peptid för att bekräfta sekvensen och renheten. Figur A visar den vertikala massan av den representativa peptidsekvensen WNK WAL var 857,90 färgförtunning. Vilket visas av förhållandet N över Zed i masspektroskopi.
Figur B visar en peptidrenhet på 99%, vilket bekräftas av HPLC. Denna peptid tillhör N+C-trunkerat peptidbibliotek. Sammanfattningsvis är metoden som beskrivs här en enkel och mångsidig som kan vara effektivt och ljus för den sista skalan kalciumbaserad screening.
Det finns dock flera faktorer som bestämmer kvaliteten på data, och därför måste sminket optimeras för ett visst cellinstrumentsystem. Tack.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
