Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

El protocolo demuestra un método rápido para la identificación de proteínas bacterianas mediante inducción antibiótica y espectrometría de masas. La principal ventaja de la técnica es su rapidez y simplicidad. La preparación de la muestra no es complicada.

La técnica se puede extender a la caracterización de cualquier bacteria patógena, como los factores de virulencia o la resistencia a los antibióticos para informar mejor el tratamiento adecuado para una infección bacteriana. Para comenzar, use un bucle estéril de un microlitro para cosechar bacterias de colonias individuales cultivadas en placa de agar LB. Y transfiera a un tubo de microcentrífuga de rosca de línea de anillo tórica de dos mililitros que contiene 300 microlitros de agua de grado HPLC.

Luego vórtice brevemente el tubo y peletice las células por centrifugación, a un agua reliquia de 0,75 microlitros del sobrenadante de muestra en el objetivo MALDI de acero inoxidable, y deje que se seque. Superponga el punto de muestra seca con 0,75 microlitros de una solución saturada de ácido sinapínico preparada en 33% de acetonitrilo, 67% de agua y 0,2% de ácido trifluoroacético, y deje que la mancha se seque. Una vez que el punto esté seco, cargue el objetivo en el espectrómetro de masas.

Abra el software de adquisición y haga clic en MS Linear Mode Acquisition Or mass-to-charge range y mass-to-charge de los límites inferior y superior en sus respectivos campos. Haga clic en el lugar de muestra que se analizará en la plantilla de destino MALDI. A continuación, deprima el botón izquierdo del ratón y arrastre el cursor sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para una ablación o ionización con láser.

Suelte el botón del mouse para iniciar la adquisición y recolectar 1000 disparos láser para cada punto de muestra. Si no se detectan iones, aumente la intensidad del láser ajustando la barra de escala móvil bajo la intensidad del láser hasta que se detecte la señal de iones de proteína. Después de completar la adquisición de modo lineal de MS, haga clic en adquisición de modo de ms/ms reflectron.

Introduzca la masa precursora que se analizará en el campo Masa precursora. A continuación, introduzca un ancho de aislamiento en daltons en la ventana Masa precursora para el lado de masa baja y alta de la masa precursora. Haga clic en el botón CID Off.

A continuación, haga clic en el botón Metastable Suppressor On. Ajuste la intensidad del láser al menos al 90% de su valor máximo ajustando la barra de escala deslizante como se ha demostrado. Haga clic en el punto de muestra que se analizará en la plantilla de destino MALDI, luego deprima el botón izquierdo del mouse y arrastre el cursor sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para la ablación láser o ionización, suelte el botón del mouse para iniciar la adquisición y recopile 10, 000 disparos láser para cada punto de muestra como se demuestra.

Haga doble clic en el archivo ejecutable Protein Biomarker Seeker y aparecerá la ventana de la interfaz gráfica de usuario. Introduzca la masa del biomarcador de proteína en el campo masa de proteína madura y el error de medición de masa en el campo de tolerancia de masa. Opcionalmente, haga clic en el botón Calculadora de masa de proteína de iones b/ a de cortesía para calcular la masa de proteínas a partir de un supuesto par de iones de fragmentos complementarios, y aparecerá la ventana emergente de la herramienta Calculadora de masa de proteínas.

Ingrese la relación masa-carga del supuesto par de iones de fragmento complementario, haga clic en el botón Agregar par y aparecerá la Calculadora de masa de proteína. Copie y pegue este valor en el campo Masa de proteína madura y cierre la ventana de herramienta Calculadora de masa de proteína. Haga clic en el cuadro Establecer restricción de residuos.

Seleccione la longitud del péptido de la señal terminal final, y aparecerá la ventana emergente con una escala deslizante y el cursor y moverá el cursor a la longitud deseada del péptido de la señal. Si no se selecciona la longitud del péptido de señal, el software realizará un truncamiento de secuencia sin restricciones. En la Condición de iones de fragmento, seleccione residuos para la escisión de la columna vertebral de polipéptidos haciendo clic en las casillas de uno o más residuos, D-E-N y / o P.Y luego haga clic en el botón Ingresar iones de fragmento más uno para buscar, y aparecerá la página emergente de fragmentos.

A continuación, haga clic en el botón Agregar ion de fragmento y aparecerá un campo desplegable para cada ion de fragmento que se ingrese. Introduzca la masa por relaciones de carga de los iones fragmento y su masa asociada por tolerancia de carga. Luego haga clic en el botón Guardar y cerrar.

En el cuadro lateral derecho de Cuántos iones de fragmento deben coincidir, desplácese para seleccionar el número mínimo de iones de fragmento que deben coincidir para su identificación y seleccione los residuos de cisteína en su estado oxidado. Si las proteínas no se identifican después de la búsqueda, repita la búsqueda con cisteínas en su estado reducido. En Configuración de archivo, haga clic en el icono Seleccionar archivo FASTA para examinar y seleccionar el archivo FASTA que contiene las secuencias de proteínas in silico de la cepa bacteriana previamente construida.

A continuación, seleccione una carpeta de salida y cree un nombre de archivo de salida. Haga clic en el icono Ejecutar búsqueda en entradas de archivo. Aparecerá una ventana emergente titulada Confirmar parámetros de búsqueda que muestra los parámetros de búsqueda antes de que se inicie la búsqueda.

Y si los parámetros de búsqueda son correctos, haga clic en Iniciar búsqueda. Si los parámetros son incorrectos, haga clic en Cancelar y vuelva a introducir los parámetros correctos. Una vez iniciada la búsqueda, la ventana de parámetros se cerrará y aparecerá una nueva ventana emergente con una barra de progreso, que muestra el progreso de la búsqueda y un recuento en ejecución del número de identificaciones encontradas.

Al finalizar la búsqueda, la barra de progreso se cerrará automáticamente y se mostrará un resumen de la búsqueda en el campo de registro de la interfaz gráfica de usuario junto con una nueva ventana emergente que muestra las identificaciones de proteínas encontradas. En el estudio actual, se cultivaron cultivos bacterianos en LB con dos concentraciones diferentes de mitomicina-C. El espectro de masas del cultivo bacteriano cultivado con una concentración de mitomicina-C.

Se identificaron la proteína de choque frío C, la proteína de choque frío E y una proteína transmitida por plásmidos de función desconocida. El ion proteína desconocido en 9780 fue analizado por MS / MS, y el ion precursor se aisló con una ventana selectora de iones de tiempo de aproximadamente 100 daltons. El fragmento ion en masa a carga 9675.9 es un derrame de la disociación del ion proteína metaestable en 9655.

La secuencia de la proteína de inmunidad para la colicina E3 contiene residuos básicos de posibles sitios de ionización. Los iones del fragmento detectados a partir de la escisión de la columna vertebral polipeptídica, cuando se utilizó la forma reducida de cisteína durante la búsqueda. La metionina N-terminal se elimina como una modificación posterior a la traducción.

Cuando el cultivo bacteriano se cultivó a una alta concentración de mitomicina-C, se identificó la proteína de inmunidad de la bacteriocina. El pico desconocido en 9651 fue analizado por MS/MS, y el ion precursor se aisló con una ventana TIS más estrecha y asimétrica de menos 75 más 60 daltons. La secuencia de la proteína de inmunidad de la bacteriocina contiene residuos básicos de posibles sitios de ionización.

Los iones del fragmento detectados a partir de la escisión de la columna vertebral polipeptídica, cuando se utilizó la forma reducida de cisteína durante la búsqueda. con las diferentes concentraciones de antibióticos, la abundancia relativa de proteínas puede variar. Y estos fueron analizados mediante espectrometría de masas.

Al cosechar células bacterianas, observe la morfología de la colonia y el crecimiento bacteriano con respecto a los antibióticos y la concentración. Un bucle de células de un microlitro es necesario para detectar proteínas.