Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה
Chapters
Summary June 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.
Transcript
שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיני חלבונים דו-קיום, כולל קונפורמיסטים או וריאנטים שונים ואפיון מקוון של הבדלי מבנה הסדר הגבוה שלהם כדי להשלים במדידת CEMS אחת. הוא משתמש באפקט האלקטרופורטי כדי לספק סביבה של כמעט 100% עבור תגובות HDX והפרדה אורתוגונלית של מיני החלבון הדו-קיום במהלך HDX לניתוח טרשת נפוצה מלמעלה למטה. התחל עם תנאים מוקדמים של אלקטרופורזה נימית, חילופי דיטריום מימן או הגדרת CE HDX.
באמצעות ultrasonication בתערובת של 50% מתנול, 49% מים ו 1% חומצה פורמית, לנקות את הזרימה באמצעות ממשק CE-MS מיקרוביאלי לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. הר את הנימים המותאמים של HPC על אלקטרופרזיס נימי או מכשיר CE. לשטוף את הנימים עם פתרון אלקטרוליטים ברקע או BGE במשך 10 דקות באמצעות סמפלר אוטומטי ולהשאיר אותו מלא עם BGE.
השתמש באורך מתאים של צינורות נימי סיליקה מותכים ללא שינוי כמו צינורות עירוי לפתרון צירוף. השתמש איחוד ושרוול מתאים כדי לחבר את צינורות מכפיל למזרק זכוכית הדוק גז עם טמפרטורת קהה ולשטוף את הצינורות עם פתרון מכפיל במשך 10 דקות לפחות באמצעות משאבת עירוי. הכנס את השקעים של צינורות CE-MS מקודדים של HPC שנטענו עם הפתרונות המתאימים לממשק CE-MS המנוקה.
לקדם את המזרק עם משאבות עירוי כך פתרון צירוף מגיע לקצה הממשק. הר את ממשק CE-MS המורכב על מקור יינון תרסיס ננו אלקטרונים דיור של ספקטרומטר מסה. החל מתח ריסוס של 3-5 קילו-וולט על ממשק CE-MS.
החדירו את פתרון הצירוף למשאבת האינפוזיה בקצב זרימה הנע בין 0.1-10 מיקרוליטרים לדקה והבטיחו תרסיס אלקטרו יציב בקצה ממשק CE-MS. מקם את בקבוקון המדגם המכיל את BGE ואת המדגם האוטומטי, אשר ישמש מאוחר יותר כדי לרכוש אלקטרופרוגרמה ריקה ספקטרום מסה ריקה. להעריך את נפח ההזרקה באמצעות הקשר בין נפח הזרקה ופרמטרים הזרקה.
ולהזריק את הפתרון לדוגמה באמצעות סמפלר אוטומטי בשני PSI למשך זמן מתאים. התחל את הפרדת CE על ידי החלת מתח אלקטרופורטי של 20 קילו-וולט בלחץ עירוי הנע בין 0-2 PSI ולרכוש את האלקטרופרוגרמה. בינתיים, לרכוש את נתוני MS במצב כרומטוגרפי שבו הגרף הנוכחי יון נרכש כפונקציה של זמן וסריקות MS המתאימות אינן משולבות באופן אוטומטי לספקטרום יחיד.
שמור את האלקטרופרוגרמה הריקה ואת ספקטרום המסה כהפניות. הניחו את הבקבוקונים לדוגמה המכילים את הריכוזים הרצויים של פתרונות דגימת החלבון בסמפלר האוטומטי ורכשו את האלקטרופרוגרמה ואת הספקטרום MS1 של מיני החלבון המופרדים אלקטרופורטית ודיאוטריום. בצע מדידות Ms.measurements דו-מושביות עבור מינים של עניין, או לאחר רכישת ספקטרום MS1 בתוך אותה ריצה או בריצה נפרדת עוקבת.
לאחר כל מדידה, לשטוף את הנימים עם BGE בלחץ של 20 PSI במשך 10 דקות לפחות. נקו את ממשק CEMS ואת כל הצינורות לאחסון עם השלמת הניסויים. השג ערכת נתונים של דגימת נקודת הקצה HDX עם MS במצב עירוי ישיר.
לחץ עירוי נמוך הביא להפרדה טובה יותר של פסגות CE, אך הוביל לעלייה הן בזמן ההגירה והן במשך הניסוי. זמן תגובה ארוך יותר של HDX הביא לרמה גבוהה יותר של הסתה של ניתוחי החלבון. השונות A ו- B של אימונוגלובולין בטא או בטא IG, אשר נבדלים על ידי רק שתי שאריות חומצת אמינו ברצף שלהם, הולידה שתי פסגות מופרדות כראוי אלקטרופרוגרמה נגזרת EIC.
הדיאוטריום הדיפרנציאלי שכותרתו שונות הביאה לחלוקת מסה ברורה של יונים. מספר נמוך יותר בשפע יחסי של יוני Z מאשר יוני C נצפתה עקב הצמדה dysofied ייחודי באישור של בטא IG המגבילים את יעילות הפיצול בין CS 82 ו CS 176. רוב יוני השברים המיוצרים מביתא IGA, ובטא IGB מציגים מידה דומה של ספיגת דיטריום.
עם זאת, המקטעים הגדולים יותר המכסים את אתרי וריאציית הרצף מביתא IGA הופחתו במידה רבה יותר באופן משמעותי מאשר בטא IGB. ה- pH של BGE מותאם על פי הנקודה האיזואלקטרית של המדגם כדי למנוע הצטברות חלבון ולהקל על ההפרדה תוך שמירה על המתחם.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
