Implantation af et kranievindue til gentagen In Vivo-billeddannelse i vågne mus

Protokollen beskriver, hvordan man udfører virale injektioner og implanterer et kranievindue til billeddannelse af hjerneceller i vågne, hovedbeherskede mus. Fordelen ved denne metode er, at struktur og aktivitet af neuroner og astrocytter kan afbildes gentagne gange over flere sessioner. Denne tilgang kan bruges til at bestemme, hvordan neurale celler ændres i modeller af neuroudviklingsmæssige eller neurodegenerative lidelser, eller om oplevelsesafhængig plasticitet er svækket.

Begynd med at fastgøre en anæstesimus til en stereotaksisk ramme ved hjælp af snudklemmen og ørestængerne. Brug sterile kirurgiske værktøjer til at skære og fjerne huden fra de frontale suturer forrest til bregma til posteriorly til lambda. Brug et sterilt kirurgisk blad i kulstofstål i størrelse 11 til at skrabe forsigtigt alt bindevævet fra kraniet.

Ved hjælp af en tandbor skal du gradvist bore kraniet langs omridset af åbningen i koncentriske cirkler for at lette jævn udtynding af knoglen. Efter hvert koncentrisk pas skal du tilføje en dråbe eller to saltvand til det borede område og lade saltvandet sidde i mindst 10 sekunder, før boringen genoptages. Skub forsigtigt på det centrale område af kraniet med fine tang for at kontrollere, at kraniet er tilstrækkeligt tyndt og bevæger sig.

Sørg for, at den underliggende vaskulatur, hvor boringen fandt sted, er intakt, og at knoglen ikke er revnet. Indsæt forsigtigt et miniature 15-graders spidst blad i den tynde knogle og skær og brug gelskummet gennemblødt i saltvand for at stoppe eventuelle blødninger, der kan opstå. Brug tang til forsigtigt at løfte og fjerne knoglen, og pas på ikke at beskadige dura mater.

Til injektionen fyldes en steril skrå glaspipette med en 20 mikrometer spids med virusblandingen. Sænk derefter pipetten for at røre ved hjernens overflade, og fortsæt med at sænke i yderligere 200 til 300 mikrometer til lag 2/3 injektioner. Ved hjælp af et intracellulært mikroinjektionsdispenseringssystem injiceres systemet 12 til 15 gange i løbet af to minutter.

Til kranievinduesimplantationen skal du placere dækglasset over åbningen i kraniet. Brug tang til at sikre, at glasset skyller over åbningen. For at forsegle glasvinduets kanter til kraniet skal du anvende cyanoacrylatklæbende gel omkring glasoverfladens omkreds.

Påfør et lag lim over klæbegelen. Tilsæt derefter et lag tandcementvæske. Når tandcement hærder, påføres et tyndt lag lim omkring den centrale åbning af helikoptertypens hovedplade og anbring helikoptertypens hovedplade af passende størrelse over dækglasset.

Lad limen tørre. Tilsæt dental cementpulver i et 1,5 ml mikrofugerør op til 0,1 milliliter mærket. Bland syv til otte dråber hurtighærdende øjeblikkeligt klæbemiddel i pulveret, og træk den resulterende blanding i en sprøjte på en milliliter med en 19 gauge nål, der er skåret for at skabe en større åbning.

Indsprøjt pulverblandingen gennem helikopterstangens sidehuller, indtil den siver fra begge sider. Påfør tandcementklæbemiddelblandingen på resten af det udsatte kranium for at fastgøre hovedpladen til kraniet. Pak musen ind i klud, og fastgør den via hovedpladen til hovedfikseringsarmen på det luftløftede hjemmebur, og lad derefter hjemmeburet være udsat for lys.

Efter en tilvænningstid på 15 minutter skal du fjerne musen fra hjemmeburet. Brug mikroskopets brede felttilstand til at vælge to til tre positioner med let identificerbar vaskulatur. Gem billederne af blodkarrene, og optag x- og y-koordinaterne, der vises på motorstyringen.

Forestil dig neuronernes synaptiske strukturer og GCaMP6f-aktivitet i astrocytter. I den repræsentative analyse blev kvaliteten af kranievinduet evalueret med gentagen billeddannelse af dendritter og GCaMP6f-ekspressiv astrocytter over dage. I et godt vindue syntes neuronale strukturer skarpe med tydeligt synlige dendritiske rygsøjler.

To nye rygsøjler dukkede op på dag to af billeddannelsen. Kun en rygsøjle fortsatte og var synlig på dag fem. Calciumaktivitet blev undersøgt i astrocytter, der udtrykte GCaMP6f på forskellige tidspunkter.

En global begivenhed, der omfattede hele cellen, blev vidne til under en bevægelseskamp. De to kritiske trin i denne protokol er, at knoglen skal tyndes tilstrækkeligt inden fjernelse af knoglen og korrekt placering af dækglasset over åbningen. Billeddannelse kan kombineres med adfærdsanalyse, enten under billeddannelse eller efter adfærd, såsom at lære en ny motorisk færdighed, for at bestemme, hvordan neuronal og astrocytstruktur og funktion moduleres ved læring.