Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen
Chapters
Summary June 22nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.
Transcript
Het protocol beschrijft hoe virale injecties moeten worden uitgevoerd en een schedelvenster kan worden geïmplanteerd voor beeldvorming van hersencellen in wakkere, in bedwang gehouden muizen. Het voordeel van deze methode is dat de structuur en activiteit van neuronen en astrocyten herhaaldelijk in beeld kan worden gebracht gedurende meerdere sessies. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen hoe neurale cellen worden veranderd in modellen van neurologische ontwikkelings- of neurodegeneratieve aandoeningen, of dat ervaringsafhankelijke plasticiteit is aangetast.
Begin met het vastzetten van een verdoofde muis aan een stereotaxisch frame met behulp van de snuitklem en oorstaven. Snijd en verwijder met behulp van steriele chirurgische hulpmiddelen de huid van de frontale hechtingen vooraan bij de bregma tot achteraan bij lambda. Schraap met behulp van een steriel maat 11 koolstofstalen chirurgisch mes voorzichtig al het bindweefsel uit de schedel.
Boor met behulp van een tandartsboor geleidelijk het schedelbot langs de omtrek van de opening in concentrische cirkels om zelfs het dunner worden van het bot te vergemakkelijken. Voeg na elke concentrische passage een druppel of twee zoutoplossing toe aan het geboorde gebied en laat de zoutoplossing minstens 10 seconden zitten voordat u het boren hervat. Druk voorzichtig op het centrale gedeelte van het schedelbot met een fijne tang om te controleren of de schedel voldoende verdund en beweegt.
Zorg ervoor dat de onderliggende vasculatuur waar de boring plaatsvond intact is en dat het bot niet is gebarsten. Steek voorzichtig een miniatuur puntig mes van 15 graden in het verdunde bot en snijd en gebruik het gelschuim gedrenkt in zoutoplossing om eventuele bloedingen te stoppen. Til met behulp van een tang het bot voorzichtig op en verwijder het, zorg ervoor dat u de dura mater niet beschadigt.
Vul voor de injectie een steriele afgeschuinde glazen pipet met een punt van 20 micrometer met het virusmengsel. Laat vervolgens de pipet zakken om het oppervlak van de hersenen aan te raken en blijf nog eens 200 tot 300 micrometer zakken voor laag 2/3-injecties. Met behulp van een intracellulair micro-injectiedoseersysteem het systeem 12 tot 15 keer gedurende twee minuten.
Voor de implantatie van het schedelvenster plaatst u het dekglas over de opening in de schedel. Gebruik een tang om ervoor te zorgen dat het glas vlak over de opening gaat. Om de randen van het glazen venster naar de schedel af te dichten, brengt u cyanoacrylaatlijmgel aan rond de omtrek van het glasoppervlak.
Breng over de zelfklevende gel een laag lijm aan. Voeg vervolgens een laag tandcementvloeistof toe. Wanneer tandcement uithardt, brengt u een dunne laag lijm aan rond de centrale opening van de kopplaat van het helikoptertype en plaatst u de kopplaat van het helikoptertype van de juiste grootte over het afdekglas.
Laat de lijm drogen. Voeg tandcementpoeder toe in een microfugebuis van 1,5 milliliter tot de 0,1 milliliter. Meng zeven tot acht druppels snel uithardende instantlijm in het poeder en trek het resulterende mengsel in een spuit van één milliliter met een naald van 19 gauge die is gesneden om een grotere opening te creëren.
Injecteer het poedermengsel door de zijgaten van de helikopterbalk totdat het van beide kanten sijpelt. Breng het tandcementlijmmengsel aan op de rest van de blootgestelde schedel om de hoofdplaat aan de schedel vast te maken. Wikkel de muis in doek en bevestig hem via de kopplaat aan de hoofdbevestigingsarm van de door de lucht verplaatste thuiskooi en laat de thuiskooi vervolgens blootgesteld aan licht.
Na een gewenningstijd van 15 minuten haalt u de muis uit de thuiskooi. Gebruik de breedveldmodus van de microscoop om twee tot drie posities van gemakkelijk identificeerbare vasculatuur te selecteren. Sla de beelden van de bloedvaten op en noteer de x- en y-coördinaten die op de motorcontroller verschijnen.
Stel je de synaptische structuren van neuronen en GCaMP6f-activiteit in astrocyten voor. In de representatieve analyse werd de kwaliteit van het schedelvenster geëvalueerd met herhaalde beeldvorming van dendrieten en GCaMP6f-tot expressie brengende astrocyten gedurende dagen. In een goed venster leken de neuronale structuren helder met duidelijk zichtbare dendritische stekels.
Twee nieuwe stekels verschenen op dag twee van de beeldvorming. Slechts één wervelkolom hield aan en was zichtbaar op dag vijf. Calciumactiviteit werd bestudeerd in astrocyten die GCaMP6f op verschillende tijdstippen tot expressie brachten.
Een wereldwijde gebeurtenis die de hele cel omvatte, was getuige tijdens een voortbewegingsaanval. De twee kritieke stappen van dit protocol zijn dat het bot voldoende moet worden verdund voordat het bot wordt verwijderd en dat het dekglas op de juiste manier over de opening wordt geplaatst. Beeldvorming kan worden gecombineerd met gedragsanalyse, hetzij tijdens beeldvorming, hetzij post-gedrag, zoals het leren van een nieuwe motorische vaardigheid, om te bepalen hoe neuronale en astrocytenstructuur en -functie wordt gemoduleerd door te leren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
