This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Rask in Vivo-fiksering og isolering av translasjonskomplekser fra eukaryote celler
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterer en teknikk for raskt å stabilisere translasjonelle (proteinbiosyntese) komplekser med formaldehyd krysskobling i levende gjær og pattedyrceller. Tilnærmingen muliggjør dissekering av forbigående mellomprodukter og dynamiske RNA:proteininteraksjoner. De krysskoblede kompleksene kan brukes i flere nedstrømsapplikasjoner, for eksempel i dype sekvenseringsbaserte profileringsmetoder, mikroskopi og massespektrometri.
Transcript
Arbeidsflyten består av voksende celler under strengt kontrollerte miljøforhold, og kjøler dem raskt ned ved hjelp av smeltende vann / is og fiksering med forhåndsoptimalisert konsentrasjon av formaldehyd og inkubasjonstid. Fikseringsreaksjonen slukkes deretter ved hjelp av overskudd av primære aminogruppeholdige forbindelser, for eksempel glycin eller tryps. Celler samles, vaskes og kan lagres frosset.
Faste celler kan være mekanisk eller kjemisk lysed, og lysatet brukes til separasjon av ribosomale fraksjoner basert på deres molekylære størrelse, sedimenteringsegenskaper eller affinitetsmarkører. Tilnærmingen resulterer i allsidig materiale som kan brukes til immunassistert rensing og deteksjon, berikelse av komplekser som inneholder spesifikke faktorer i elektronmikroskopi. Ved krysskoblet dyp blokkering blir RNA-forsterkning eller hybridiseringsbaserte analyser, RNA-sekvensering og massespektrometri mulig.
Sett opp en en-liters gjærkultur i en orbital shaker med en start optisk tetthet ikke mer enn 0,05 absorbansenheter ved 600 nanometer og bruk peptone og dextrose media ved 30 grader celsius. Sett opp en forberedende sentrifuge med kompatibel rotor og sentrifugeflasker for pelleting av flytende suspensjon av gjærceller ved 5000 G ved fire grader celsius. Hold oversikt over den optiske tettheten til vekstcellene.
Det må være mellom 0,6 og 0,8 absorbansenheter og 600 nanometer på innsamlingstidspunktet hvis den eksponentielle vekstfasen er av interesse. Når cellene er klare, sett opp en isboks inne i den kjemiske avtrekkshetten med en baker som inneholder 250 gram ren knust vannis og viser deg også 25 milliliter trypsin og nykjøpt metanol stabilisert 37% formaldehydløsning inne i hetten. Hell den siste cellekulturen inn i bakeren som inneholder isen.
Tilsett deretter 75 milliliter 37% formaldehyd til en endelig konsentrasjon på 2,2% vekt over volum, rør blandingen intenst til isen smelter. Når isen er smeltet, sett opp en timer i 10 minutter Etter inkubering i 10 minutter, overfør kulturen til de forhåndskjølte sentrifugeflaskene og pellet cellene ved sentrifugering ved fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Mens spinnet er, på forkjøl et 50 milliliterrør og hold nylaget buffer A som inneholder glycin for å nøytralisere gjenværende formaldehyd på is.
Etter sentrifugering plasserer du sentrifugerørene på isen med pelletssiden i kontakt med isen. Før rørene inn i avtrekkshetten og kast supernatanten i en formaldehydavfallsbeholder. Re-suspendere cellepellet fra gamle rør i 20 milliliter buffer A ved hjelp av en 25 milliliter stripette og overføre til en 50 milliliter rør.
Utgjør volumet til 40 milliliter med buffer A og samle vaskecellene ved sentrifugering av fire grader celsius, 5000 G i fem minutter. Kast supernatanten og suspender cellepelletet i 40 milliliterbuffer A, som er buffer A som ikke inneholder glycin for å fjerne glycinforurensning. Pellet cellene igjen ved sentrifugering ved fire grader celsius, 5000 G fem minutter.
Gjenta vaskene med buffer A en, en gang til. Kast supernatanten og legg cellepelleten på is. Vei røret med pellets, den våte cellemassen skal være omtrent ett gram per en liter cellekultur.
Fyll opp polystyren fra esken foret med aluminiumsfolie med flytende nitrogen til en dybde på omtrent tre centimeter. Plasser på 50 milliliterrør oppreist i esken. Re-suspendere pellet i 550 mikroliter buffer A to ved pipettering og virvel i 10 sekunder.
Tilsett 10 mikroliter med 40 enheter per mikroliter RNase-hemmer og virvel igjen i 10 sekunder. Bruk en en milliliter pipette, drypp cellefjæringen inn i 50 milliliter to som inneholder flytende nitrogen. For å forberede seg på neste trinn, forkjøl 1,5 milliliter kjernefrie rør på tørris og 10 milliliter slipeglass i rustfritt stål.
Overfør de frosne celleopphengsdråpene i krukkene ved hjelp av en ren steril spatel. Senk slipeglassene ned i flytende nitrogen i ett minutt, og sørg for at væskefasen forblir over krysset. Sett opp en Cryo miksefabrikk på 27 Hertz for agitasjon i ett minutt.
Rør de forseglede slipeglassene på 27 Hertz i ett minutt i mikserfabrikken. Avkjøl glassene i flytende nitrogen som før og rist i ett minutt til. Overfør glassene til isboksen som inneholder tørris sammen med de 1,5 milliliterkjernefrie rørene.
Ved hjelp av en liten stålspatel overføres resultatene i polstret slipedato inn i rørene. Lagre deretter rørene på minus 80 grader celsius. I to T175 kolber vokser HEK 293 celler til 60 til 70% samløp og Dalbekos modifiserte Eagle medium og 10% foster bovin serum ved 37 grader og 5% karbondioksid.
Minst tre timer før ønsket fikseringstid, bytt ut T175-kolben med nøyaktig 30 milliliter forvarmede komplette medier. Forbered en isboks til randen med knust vannis og hold i avtrekkshetten sammen med nødvendige buffere, også en is. For å slå av cellene, fjern T175-kolben fra inkubatoren og trykk den formelt mot isen og sørg for maksimal overflatekontakt.
Inne i en kjemisk avtrekkshette vipper du kolben på siden slik at mediet samler seg på siden motsatt av cellene. Pipette 168 mikroliter på 37% veid av volum formaldehyd direkte inn i de samlede mediene. Gir en endelig konsentrasjon på 0,2% formaldehyd.
Bland umiddelbart. Inkuber kolbe på is i 10 minutter videre. Hell av mediet i en passende avfallsbeholder gjennom kolbesiden motsatt av cellene.
Ved hjelp av en flenta, pipette i 30 milliliter av Dalbekos fosfat bufret saltvann uten kalsium og magnesiumioner og i tillegg inneholder 50 millimolar glycin forsiktig på siden motsatt av cellene. Bland ved å gynge kolben, returner blitsen til horisontal posisjon og inkuber i 10 minutter mer på is. Hell av løsningen gjennom kolbesiden motsatt av cellen og tilsett forsiktig syv milliliter standard 0,25% trypsin EDTA-løsning for å løsne og suspendere cellene på nytt.
Inkuber kolben ved romtemperatur i fem, maksimalt 10 minutter. Finn kolben vertikalt og bruk en flåktur, samle de frittliggende cellene ved å forsiktig vaske eventuelle gjenværende fra kolbeveggene og overfør suspensjonen til et 50 milliliterrør satt på is. Suppler straks den oppsamlede fjæringsløsningen med 20 milliliter komplette medier og bland ved å snu røret forsiktig.
Pellet cellene ved å sentrifugere røret ved 100 G i fem minutter og fire grader celsius. Cellepellet må være tydelig synlig. Hell av media og re-suspendere pellets forsiktig i 10 milliliter av Dalbekos fosfat bufret saltvann uten glycin.
Sentrifuger røret igjen ved 100 G i fem minutter og ved fire grader celsius Hell av vaskebufferen og re-suspender pellet i 800 mikroliter av iskald Dalbekos fosfatbufret saltvann uten glycin, men inneholder magnesium og kalsiumioner. Overfør de re-suspenderte cellene til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikro sentrifuger. Sentrifuger røret ved 100 G i tre minutter ved fire grader celsius.
Kast forsiktig supernatanten ved å bruke en milliliter pipetter. På dette stadiet kan cellepellet fryses ved minus 80 grader celsius eller fortsette til cellelystrinnet. I et biosikkerhetsskap tilsettes 300 mikroliter lysisbuffer basert på ikke-ionisk, ikke-denaturing vaskemiddel, og syv mikroliter arginasehemmer og bland godt ved pipettering ved hjelp av en milliliterspiss.
Fest forsiktig en 25 gauge nål til en en til tre milliliter sprøyte og rør blandingen kraftig ved hjelp av minst syv sakte oppadgående inntak og raske nedadgående eksosslag. Kast sprøyten og kanylen i den skarpe beholderen og gjenta prosedyren med en 31 gauge nål og 0,3 milliliter sprøyte. Kast sprøyten og kanylen i den skarpe beholderen.
Sentrifuger røret ved 12.000 G i fem minutter ved fire grader for å fjerne celleavfallet. Overfør supernatanten til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 milliliter mikro sentrifuger. Oppbevar både cellerester og lysat ved minus 80 grader celsius.
Translasjonskomplekser er følsomme for bufferens ioniske sammensetning. Utelatthet av magnesiumklorid og tilsetning av EDTA abrogerte høye sedimenteringsegenskaper, og mens kalsiumklorid resulterte i bedre resultattopper, var forbedringen marginal. Vi valgte dermed buffer 1.
2,2% vekt etter volum formaldehyd utmerket bevart polysomene og reduserte ikke det totale utbyttet sammenlignet med 4% vekt etter volum formaldehyd. I pattedyrceller ble det brukt en mye lavere konsentrasjon av formaldehyd på 0,2% vekt etter volum. Ettersom høyere konsentrasjoner resulterte i betydelig polyribosomalt materialtap.
15 millimolar EDTA lagt til lysatet og alle påfølgende buffere viste karakteristisk mindre destabiliseringseffekt på polysomale fraksjoner, avledet fra de faste cellene. Og denne effekten ble delvis replikert med 50 millimolar EDTA med materiale fra 4% faste celler, motstår, utfolder seg bedre. Glukoseuttømming fremkaller en av de mest dramatiske og raske translasjonshemmende effektene på gjær.
Både nerve tilsatt og lokalt forårsake forhold indusert polysom demontering var litt, men tydeligvis flere polysomer beholdt i lav tilsatt glukose. Det er viktig at polysomalt materiale fra de faste cellene viser et høyt skille mellom de sultne og ikke-sultne cellene som indikerer egnetheten til formaldehydfiksering for å bevare forskjeller i dynamiske oversettelsesprosesser. I tilnærminger som tacy paysake, kan det i tillegg være innsiktsfullt å fjerne små ribosomale underenheter som ikke samvirker godt med de komplette rhizomene som vi brukte en to-trinns ultracentrifugation, slik at isolasjonen av SSU, LSU, RS, RNase-resistente diazomer, DS og høy ordens polysomer bekreftet av elektronmikroskopi av de faste fraksjonene.
Sammenlignet med de ikke-faste cellene, viste materiale fra de faste cellene forhøyet tilstedeværelse av labile eIF4A i de raskeste sedimenterende ribosomale fraksjonene. Ved hjelp av fast materiale fra eIF4A tapi-stammen for å fange og berike eIF4A som inneholder komplekser med magnetiske IDG-perler, kunne vi observere selektiv berikelse av eIF4A sammenlignet med beta-aktin i SSU og RS, men ikke LSU-fraksjoner fra den andre gradienten på RNase en demontering. Sammenlignet med andre metoder for translasjonell hvile, lover hurtigheten av formaldehydvirkning på tvers av cellemembraner og den ukritiske karakteren av krysskoblinger bevaring av det maksimale mangfoldet av oversettelseskomplekser.
Våre funn samsvarer med brukervennligheten til rask formaldehydfiksering for å stabilisere svært forbigående komplekser og beviss nytte i scenariene for raske cellulære responser på miljøendringer eller stressforhold.
Tags
Biologi utgave 178 øyeblikksbilde av proteinbiosyntese oversettelseskompleksstabilisering raske celleresponser cellulær stress ribosomale komplekser affinitetsrensing av oversettelses-mellomprodukter translasjonskontroll oversettelseskompleksprofilsekvensering TCP-seq ribosom (oversettelse) profilering ribo-seq ribosomsedimentering ved ultracentrifugation i sukrose gradientRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
