Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Raske, enzymatiske metoder for forsterkning av minimale, lineære maler for proteinprototyping ved hjelp av cellefrie systemer
Chapters
Summary June 14th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Studien beskriver en protokoll for å lage store (μg-mg) mengder DNA for proteinscreeningskampanjer fra syntetiske genfragmenter uten kloning eller bruk av levende celler. Den minimale malen er enzymatisk fordøyd og sirkulærisert og deretter forsterket ved hjelp av isotermisk rullesirkelforsterkning. Cellefrie uttrykksreaksjoner kan utføres med det ubetenkne produktet.
Transcript
Denne protokollen er viktig fordi den beskriver hvordan man raskt kan generere store mengder DNA-mal for bruk i cellefrie reaksjoner fra et lite genfragment mottatt fra et synteseanlegg. Rullende sirkelforsterkning kan generere store mengder DNA raskere enn tradisjonell kloning. Så den støtter høyere gjennomstrømningsdesign bygge test lære sykluser fra biblioteker av syntetisk DNA.
Disse teknikkene kan ha stor iboende variasjon for nye brukere på grunn av de mange trinnene og små volumene som kreves. Forsiktig oppmerksomhet bør gis til teknikken, og praksis gjør perfekt. Til å begynne med, legg til alle komponentene fra et PCR-sett i et enkelt PCR-rør.
Tilsett deretter en mikroliter av det gjenbrukte genfragmentet. Homogeniser blandingen forsiktig ved å virvelere på en middels innstilling i fem til 10 sekunder. Etter programmering av termosykleren i henhold til kit produsentens protokoll, kjør PCR.
Når PCR er fullført, bruk et PCR-oppryddingssett for å rense DNA-et fra reaksjonsblandingen. I et 1,5 milliliterrør legger du til DNA-bindingsbufferen og PCR-prøven med et fem til ett forhold. Overfør denne blandingen til spinnkolonnen og sentrifuger ved 16 000 ganger G i ett minutt.
Kast gjennomstrømningen. Tilsett 200 mikroliter av DNA-vaskebufferen i kolonnen og inkuber den ved romtemperatur i ett minutt. Sentrifuger kolonnen igjen og kast gjennomstrømningen.
Vask kolonnen igjen med DNA-vaskebufferen, som vist. Etter å ha kastet gjennomstrømningen fra den andre vasken, fjern eventuell gjenværende buffer ved å sentrifugere kolonnen i ytterligere ett til to minutter. For å unnvike DNA-et, overfør kolonnen til et nytt 1,5 milliliterrør.
Tilsett deretter 46 mikroliter dobbeltdestillert vann i kolonnen. Etter ett minutts inkubasjon samler du DNA-et inn i røret ved sentrifugering. Og kvantifisere det rensede DNA-et ved hjelp av et spektrofotometer.
For å fordøye og sirkularisere DNA-et, kombiner fem mikroliter av den nødvendige reaksjonsbufferen, 20 enheter av HindIII-begrensningsenzymet og 45 mikroliter av det rensede DNA-et i et PCR-rør. Bruk en pipette, homogeniser forsiktig denne blandingen. Deretter inkuberer du den i en termocycler i 15 minutter ved 37 grader Celsius.
Etter at inkubasjonen er fullført, inaktiverer varmen hindIII-enzymet ved å inkubere i 20 minutter ved 80 grader Celsius. Tilsett deretter fem mikroliter T4 Ligase buffer og 800 enheter av T4 Ligase til det nylig fordøyde DNA. Etter forsiktig blanding med en pipette, inkuber blandingen i en time ved 25 grader Celsius for å utføre sirkulariseringsreaksjonen.
Når reaksjonen er fullført, renser du DNA-et ved hjelp av et PCR-oppryddingssett som vist tidligere. Deretter kvantifiserer du DNA-et. For å utføre den rullende sirkelforsterkningen, kombiner alle reaksjonskomponenter og en mikroliter av den rensede sirkulære uttrykksmalen i et enkelt rør.
Homogeniser blandingen med en pipette og aliquot 10 mikroliter av blandingen i fire separate rør. Inkuber rørene ved 30 grader Celsius i fire til 18 timer, og varm deretter enzymet ved å inkubere ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Etter varmeinaktivering, oppmuntre kondens på bunnen av røret ved å inkubere ved 12 grader Celsius i fem minutter.
Deretter fortynner du den resulterende løsningen ved å legge til 15 mikroliter dobbeltdestillert vann til hvert rør. Kombiner innholdet i hvert rør før du renser og kvantifiserer DNA-et som vist tidligere. For å utføre den cellefrie reaksjonen, legg til de forskjellige nødvendige komponentene i et rør og fortynn til det endelige ønskede volumet med dobbeltdestillert vann.
Bland oppløsningen grundig ved å pipettere halvparten av oppløsningen opp og ned 10 til 20 ganger. Overfør reaksjonsblandingen i 15 mikroliter aliquots til de ønskede brønnene i mikrotiterplaten. Forsegle deretter platen med en fargeløs tetningsfilm for å opprettholde fuktighet og forhindre fordampning.
Plasser den forseglede platen i plateleseren og la reaksjonen fortsette å fullføres. Hvis du uttrykker subtilisin BPN-genet ved hjelp av det cellefrie systemet, aliquot 94 mikroliter dobbeltdestillert vann og en mikroliter på 10 mikromolar PNA i en flatbunn, fargeløs 96 brønnplate. Legg deretter til fem mikroliter av den ferdige cellefrie reaksjonen og les platen ved hjelp av en plateleser satt til å måle absorbans ved 410 nanometer hvert 20.
Uttrykk for Superfolder GFP i BL21 DE3 stjerne ekstrakt ved hjelp av bare 3 mikroliter av unyttifisert RCA DNA i en 15-mikroliter reaksjon er sammenlignbar med PJL1 plasmid. Dobling og tredobling av malmengdene ser ikke ut til å gi noen åpenbar fordel, noe som tyder på allerede mettede nivåer av malen ved 3 mikroliter per reaksjon. Omvendt ser det ut til å være en fordel å øke mengden RCA-mal når du bruker shuffle-strekkcelleekstraktet.
Proteiner som krever lavere temperaturer eller lengre foldetider, påvirker tiden det tar å fullføre hele arbeidsflyten. For eksempel fører analyse av subtilisin etter fire timers uttrykk til et mislykket resultat, da fire timer ikke er nok for subtilisinmodning. Men å la reaksjonen fortsette til 16 timer fører til påvisbare nivåer av subtilisin.
Alle komponenter må være godt blandet for at denne protokollen skal fungere med maksimal effektivitet. Etter disse metodene kan et stort bibliotek med proteinkandidater genereres syntetisk og deretter uttrykkes med tilstrekkelig utbytte for karakterisering. Denne metoden banet vei for gruppen vår til å utvikle N C to sensorer som kan fungere i celleekstrakter, slik at vi raskt kan karakterisere prototypeproteinet.
Dette vil gjøre oss i stand til raskere og intelligent å gjenta proteindesign av nye biokatalysatorer og terapier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
