Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Snabba, enzymatiska metoder för förstärkning av minimala, linjära mallar för proteinprototyper med cellfria system
Chapters
Summary June 14th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Studien beskriver ett protokoll för att skapa stora (μg-mg) mängder DNA för proteinscreeningskampanjer från syntetiska genfragment utan kloning eller användning av levande celler. Den minimala mallen smälts och cirkulariseras enzymatiskt och förstärks sedan med hjälp av istermisk förstärkning av rullande cirkel. Cellfria reaktioner kan utföras med den icke-försedda produkten.
Transcript
Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det beskriver hur man snabbt genererar stora mängder DNA-mall för användning i cellfria reaktioner från ett litet genfragment som mottagits från en syntesanläggning. Förstärkning av rullande cirkel kan generera stora mängder DNA snabbare än traditionell kloning. Så det stöder högre genomströmning design bygga test lära cykler från bibliotek av syntetiskt DNA.
Dessa tekniker kan ha stor inneboende variabilitet för nya användare på grund av de många steg och små volymer som krävs. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt tekniken, och övning gör perfekt. Till att börja med, lägg till alla komponenter från ett PCR-kit i ett enda PCR-rör.
Tillsätt sedan en mikroliter av det återupplivna genfragmentet. Homogenisera blandningen försiktigt genom att virvla på en medelhög inställning i fem till tio sekunder. Efter programmering av termocykeln enligt kittillverkarens protokoll, kör PCR.
När PCR har slutförts ska du använda ett PCR-rengöringskit för att rena DNA från reaktionsblandningen. Tillsätt DNA-bindningsbufferten och PCR-provet i ett 1,5 milliliter rör i ett 1,5 milliliterrör. Överför denna blandning till spinnkolonnen och centrifugera vid 16 000 gånger G i en minut.
Kasta bort flödet genom. Tillsätt 200 mikroliter av DNA-tvättbufferten till kolonnen och inkubera den vid rumstemperatur i en minut. Centrifugera kolonnen igen och kassera genomströmningen.
Tvätta kolonnen en gång till med DNA-tvättbufferten, vilket visas. När du har kastat genomströmningen från den andra tvätten, ta bort eventuell återstående buffert genom att centrifugera kolonnen i ytterligare en till två minuter. För att undkomma DNA: t, överför kolonnen till ett nytt 1,5-milliliterrör.
Tillsätt sedan 46 mikroliter dubbeldestillerat vatten i kolonnen. Efter en minuts inkubation samlar du in DNA i röret genom centrifugering. Och kvantifiera det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.
För att smälta och cirkulärisera DNA, kombinera fem mikroliter av den nödvändiga reaktionsbufferten, 20 enheter av HindII-begränsningsenzymet och 45 mikroliter av det renade DNA i ett PCR-rör. Använd en pipett, homogenisera försiktigt denna blandning. Inkubera den sedan i en termocykel i 15 minuter vid 37 grader Celsius.
När inkubationen är klar, värm in hindiii enzymet genom att inkubera i 20 minuter vid 80 grader Celsius. Lägg sedan till fem mikroliter T4 Ligase-buffert och 800 enheter T4 Ligase till det nyligen smälta DNA: t. Efter att försiktigt ha blandat med en pipett, inkubera blandningen i en timme vid 25 grader Celsius för att utföra cirkulariseringsreaktionen.
När reaktionen är klar, rena DNA med hjälp av ett PCR-rensningskit som visats tidigare. Kvantifiera sedan DNA: t. För att utföra förstärkningen av rullcirkeln, kombinera alla reaktionskomponenter och en mikroliter av den renade cirkulära uttrycksmallen i ett enda rör.
Homogenisera blandningen med en pipett och alikvot 10 mikroliter av blandningen i fyra separata rör. Inkubera rören vid 30 grader Celsius i fyra till 18 timmar och värm sedan in enzymet genom att inkubera vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Efter värmeinaktivering, uppmuntra kondens i botten av röret genom att inkubera vid 12 grader Celsius i fem minuter.
Späd sedan ut den resulterande lösningen genom att tillsätta 15 mikroliter dubbeldestillerat vatten till varje rör. Kombinera innehållet i varje rör innan du renar och kvantifierar DNA:t som visats tidigare. För att utföra den cellfria reaktionen, tillsätt de olika nödvändiga komponenterna i ett rör och späd till den slutliga önskade volymen med dubbeldestillerat vatten.
Blanda lösningen noggrant genom att leda halva lösningen upp och ner 10 till 20 gånger. Överför reaktionsblandningen i 15-mikroliter alikvoter till önskade brunnar i mikrotiterplattan. Försegla sedan plattan med en färglös tätningsfilm för att bibehålla fuktigheten och förhindra avdunstning.
Placera den förseglade plattan i plattläsaren och låt reaktionen fortsätta till slutförandet. Om du uttrycker subtilisin BPN-genen med hjälp av det cellfria systemet, aliquot 94 mikroliter av dubbeldestillerat vatten och en mikroliter av 10 mikromolar PNA i en platt botten, färglös 96 brunnsplatta. Tillsätt sedan fem mikroliter av den färdiga cellfria reaktionen och läs av plattan med en plattläsare inställd för att mäta absorbansen vid 410 nanometer var 20: e sekund i 10 minuter samtidigt som en temperatur på 25 grader Celsius bibehålls.
Uttryck av Superfolder GFP i BL21 DE3 stjärnextrakt med endast 3 mikroliter av ej utsmätt RCA DNA i en 15-mikroliter reaktion är jämförbar med PJL1 plasmid. Fördubbling och tredubbling av mängden mall verkar inte erbjuda någon uppenbar fördel, vilket tyder på redan mättade nivåer av mallen vid 3 mikroliter per reaktion. Omvänt verkar det finnas en fördel med att öka mängden RCA-mall när du använder shuffle stam cell extrakt.
Proteiner som kräver lägre temperaturer eller längre vikningstider påverkar den tid som krävs för att slutföra hela arbetsflödet. Till exempel, analysera subtilisin efter fyra timmars uttryck leder till ett misslyckat resultat, eftersom fyra timmar inte räcker för subtilisin mognad. Att tillåta reaktionen att fortsätta till 16 timmar leder dock till detekterbara nivåer av subtilisin.
Alla komponenter måste vara väl blandade för att detta protokoll ska fungera maximalt effektivt. Efter dessa metoder kan ett stort bibliotek av proteinkandidater genereras syntetiskt och sedan uttryckas med tillräcklig avkastning för karakterisering. Denna metod banade väg för vår grupp att utveckla N C två sensorer som kan fungera i cellextrakt, så att vi snabbt kan karakterisera prototypproteinet.
Detta kommer att göra det möjligt för oss att snabbare och intelligentare iterera på proteindesign av nya biokatalysatorer och terapier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
