Fluorescerende måling i realtid af synaptiske funktioner i modeller af amyotrofisk lateral sklerose

Disse metoder muliggør hurtig vurdering af, om en eksperimentel manipulation, sygdomsfremkaldende protein eller RNA kan påvirke synaptiske processer, og om terapeutiske forbindelser kan genoprette funktionen. Disse teknikker giver en pålidelig aflæsning af synaptisk funktion fra en gruppe neuroner på relativt kort tid sammenlignet med elektrofysiologi. Denne protokol kan anvendes på enhver sygdom med neuronal udvikling eller degeneration.

Dette fungerer godt for primære gnaverneuronale kulturer og for neuroner afledt af inducerede pluripotente stamceller. Til at begynde med skal du optimere indstillingerne for billedoptagelse ved hjælp af konfokal billedoptagelsessoftware. Hold eksponeringstiden for excitationseffekt, detektorforstærkning og billedhastighed konstant på tværs af alle prøver.

For timelapse-billeddannelse skal du vælge et billedformat på 512 x 512 og en billedhastighed på to billeder i sekundet for at minimere farveblegning. Vælg derefter kombinationerne fluorescensexcitation, dichroic og emissionsfilter for GCaMP seks M / GCaMP tre med Fitzy og stearoylfarvestof med Trixi. For at undgå Z-drift under tidsforløbsbilleddannelse skal du bruge den perfekte fokusfunktion i softwaren til erhvervelse af konfokal billeddannelse.

Vælg derefter tidsfanen i panelet til billedoptagelse. For fase et skal du indstille intervallet 500 millisekunder og varighed tre til fem minutter. Og for fase to skal du indstille interval 500 millisekunder og varighed, fem minutter.

For derefter at samle tyngdekraftsperfusionsapparatet til kunstig cerebrospinalvæske eller ACSF skal du lægge ACSF-bufferen med højt kaliumchlorid i en 50 ml sprøjte øverst på apparatet og indstille strømningshastigheden til en milliliter pr. Minut. Læg derefter en 35 ml glasskål indeholdende neuroner på det konfokale billeddannelsestrin med enden af perfusionsslangen placeret ved skålkanten og vælg feltet til billeddannelse. 48 timer efter transfektion inkuberes de primære kortikale eller motorneuroner i ACSF-buffer med lavt kaliumchlorid i 10 minutter ved 37 grader Celsius.

Fjern derefter bufferen ved aspiration, og ved hjælp af en pipette lægges neuronerne i mørket på en glasbund Petriskål fyldt med ACSF indeholdende 50 millimolært kaliumchlorid og 10 mikromolært styrylfarvestof. Efter fem minutter skal du fjerne belastningsopløsningen og bade neuronerne i ACSF-buffer med lavt kaliumchlorid ved 37 grader Celsius i 10 minutter for at eliminere den uspecifikke farvestofbelastning. Placer derefter skålen på billeddannelsestrinnet i det omvendte konfokale mikroskop og observer cellerne under et 20 gange luftmål eller 40 gange olienedsænkningsmål.

Excite stålfarvestoffet ved hjælp af en 546 nanometer laser og opsaml emission ved hjælp af et 570 til 620 nanometer båndpasfilter. Når du har valgt billedfeltet og engageret perfekt fokus, skal du tage et enkelt stillbillede med lyse felt-, Trixi- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser. Start derefter Run Now i anskaffelsessoftwaren, og udfør den basale optagelse i tre til fem minutter for at udelukke variationer i farveintensiteten.

Lige ved kontakten til fase to skal du udløse tænd-knappen til perfusionssystemet og konstant perfuse 50 millimolært kaliumchlorid til neuronerne for at lette aflæsning af farvestoffer. Udfør optagelserne i fem minutter, og udløs derefter sluk-kontakten for perfusionssystemet. Gem eksperimentet til dataanalyse senere ved hjælp af den konfokale software.

48 timer efter transfektion med GCaMP seks M, inkuber de primære gnaverkortikale neuroner med lavt kaliumchlorid ACSF i 15 minutter. Monter derefter fadet på billedbehandlingsplatformen og visualiseret GCaMP seks M fluorescens ved hjælp af et Fitzy-filter og et 20 gange eller 40 gange objektivt. Når du har valgt billedfeltet og engageret perfekt fokus, skal du tage et enkelt stillbillede med brightfield-, Fitzy- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser.

Start derefter Kør nu i erhvervelsessoftwaren og udfør den basale optagelse i tre til fem minutter. Derefter perfuser ACSF indeholdende 50 millimolært kaliumchlorid til neuronerne som tidligere påvist og optag i fem minutter. Når billedoptagelsen stopper, skal du gemme eksperimentet og fortsætte til dataanalyse ved hjælp af den konfokale software.

Til billedanalyse skal du åbne timelapse-billederne i den konfokale software og justere billederne ved at klikke på Billede efterfulgt af behandling efterfulgt af juster det aktuelle dokument og derefter vælge Juster til den første ramme. Vælg områder af interesse langs neuritterne ved hjælp af ROI-udvælgelsesværktøjet, og markér også et INVESTERINGSAFKAST, der repræsenterer baggrundsfluorescensintensitet. Start derefter målefunktionen fra tidsmålingspanelet for at måle rå fluorescens over tid for de valgte ROI’er.

Efter måling eksporteres de rå fluorescensintensiteter til regnearkssoftwaren. Dyrkede rotte primære kortikale neuroner fyldt med styrylfarvestof er vist her. Specificiteten af farvestofbelastning blev bestemt ved co-mærkning med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin, og størstedelen af sterilt farvestof positivt puncta er co-positive for denne markør.

Analysen af de rå intensitetsværdier over hele billeddannelsesperioden afslører, at synaptophysin og intensitet forbliver konstant, mens styrylfarvestofintensiteten falder efter stimulering. For grønne fluorescerende proteintransfekterede kontrolneuroner resulterede vellykket synaptisk vesikelfrigivelse i det slående tab af farvestoffluorescens ved høj kaliumchloriddepolarisering. Denne repræsentative video viser en neuron, der selektivt losser styrylfarvestof i en ny højre region efter stimulering.

I modsætning hertil er nedsat synaptisk transmission i neuroner transfekteret med en C ni ORF 72 bundet til farvestofpeptidgentagelseskonstruktion til GA 50 repræsenteret ved tilbageholdt farvestoffluorescens, selv efter depolarisering af højt kaliumchlorid. Repræsentative fluorescensbilleder af kortikale neuroner transfekteret med GCaMP seks M før og efter depolarisering af kaliumchlorid er vist her. Øgede fluorescensværdier og kortikale neuroner transfekteret med GCaMP seks M indikerer calciumindgang til neuritter efter kaliumchloridinduceret depolarisering.

I slutningen af baseline-optagelsesperioden udtrykte neuronerne GCaMP seks M med en lav fluorescens. En dramatisk fluorescensforøgelse observeres derefter i starten af stimuleringen. Sørg for, at fluorescens baseline optagelser for styrylfarvestof og GCaMP er stabile.

Brug altid perfekt fokus for at undgå billeddrift, hvilket ville gøre databehandling efter billedet udfordrende. Yderligere dyrkning af neuroner anbefales ikke, da retter udsættes for luft under overflod. Imidlertid kan immunfarvning eller ekstraktion af protein eller RNA vurdere potentielle årsager til synaptiske ændringer.