Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het proces van arteriogenese in vivo te analyseren door de hechting en extravasatie van immuuncellen in groeiende collaterale slagaders in realtime te volgen. De multifotonenmicroscopietechniek maakt de visualisatie mogelijk van celdynamica in het diepe weefsel van levende muismodellen met lage fototoxiciteit en met een hoge spatiotemporale resolutie. De microscoopprocedure wordt gedemonstreerd door Dominic van den Heuvel, een technisch assistent van het multifoton imaging platform uit het laboratorium van Dr.Helen Ishikawa-Ankerhold.

Ik zal de chirurgische procedure demonstreren. Plaats om te beginnen de verdoofde muis in rugligging. Plaats vervolgens twee stukken gegoten klei onder de bovenste achterpoot van de muis om een vlakke positie van de adductorenpier te garanderen.

Plaats de muis onder de stereomicroscoop. Na het verwijderen van het haar van beide benen, desinfecteer en knip de huid in een cirkel rond het litteken van de eerdere femorale slagaderligatie van de rechter achterpoot. Verwijder de huid en vetlaag van de bovenkant van het been en trek de resterende huid opzij met behulp van hechtingen om een zak rond de adductorspier te creëren met de collaterale vaten.

Verwijder vervolgens het onderhuidse vet om een duidelijk zicht te krijgen op de adductorenspier, de profunda-slagader en ader, evenals de collaterale bloedvaten. Verwijder de oppervlakkige spierlaag bovenop de collaterale vaten met een fijne tang. Vul de voorbereide zak met zoutoplossing om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt en ga door met dezelfde procedure voor de schijnoperatie linkerachterpoot.

Voeg voor het fotograferen ultrasone gel toe in beide zakken die uitdroging voorkomt en dient als een onderdompelingsmedium voor optische koppeling met het objectief. Schakel de sleutel van de titanium saffierlaserdoos, de elektronische interfacebox, de verwarmingseenheid van de incubatorkamer, de fluorescentielamp en de computer in. Start de acquisitiesoftware.

Stel de golflengte in op 800 nanometer en open de sluiter van de microscoop. Kies in het dialoogvenster van de meetwizard de instrumentmodus als enkele bundel en de meetmodus als time-lapse voor 3D-scans. Breng vervolgens de verdoofde muis over in de voorverwarmde incubatiekamer van de microscoop en plaats het gebied met de ultrasone gel direct in contact met de objectieve frontlens.

Open de sluiter van de epifluorescentiemicroscoop. Kies vervolgens een geschikte filter- of dichroïsche instelling voor FTSE-visualisatie. Definieer het interessegebied door de bloedstroom te volgen onder epifluorescentieverlichting.

Nadat u het interessegebied in het middelste gezichtsveld hebt gebracht, sluit u de epifluorescentiemicroscoopsluiter. Stel in het dialoogvenster XY-scanner de vereiste parameters in voor afbeeldingsgrootte, pixel, frequentie en lijngemiddelde. Pas het laservermogen aan en stel de versterking van de fotovermenigvuldigingsfactor in voor de kanalen groen, rood en blauw.

Selecteer een adequaat objectief voor instellingen voor intravitale beeldvorming en driftcorrectie. Definieer het afbeeldingsstapelbereik door de voorbeeldacquisitiemodus te starten door op de rode knop in het dialoogvenster van de metingswizard te drukken. Om goede beelden te verkrijgen, definieert u het gebied en de structuur van belang door scherp te stellen.

Terwijl u het scherm observeert, wijzigt u de focus door het objectief te verplaatsen totdat de afbeelding verdwijnt en stelt u deze in op nul. Stel de objectieve positie in als de laatste positie in de axiale richting. Verander vervolgens de focus in de tegenovergestelde richting door het objectief naar beneden te verplaatsen totdat het beeld weer van het scherm verdwijnt.

Klik op de stopknop in de linkerbovenhoek van het dialoogvenster van de meetwizard en stel de stapgrootte in op twee micrometer. Kies de python-as als het eerste asapparaat in het dialoogvenster van de meetwizard en selecteer de modus voor automatisch opslaan niet activeren. Vink vervolgens het vakje voor automatisch opslaan alleen op de tijdas aan.

Druk vervolgens op het Python-pictogram in het venster met beschikbare apparaten om het dialoogvenster Python te openen. Voer in de asinstellingen van het dialoogvenster Python de secties van en naar in en voer vervolgens het aantal stappen in. Ga naar het dialoogvenster XYZ fase Z en vergroot het scanbereik aan beide uiteinden met 200 micrometer.

Om dit te doen, voert u 200 micrometer in start in en voert u min 240 micrometer in end in en het bereik wordt automatisch ingesteld als minus 440 micrometer. Open het Front-end dialoogvenster van VivoFollow. Start de beeldacquisitie door op de groene pijlpunt in de linkerbovenhoek van het dialoogvenster van de meetwizard te drukken.

Als live driftcorrectie wordt gebruikt, zoekt u naar een dialoogvenster waarin de driftcorrectieconfiguratie wordt weergegeven. Stel vervolgens het acquisitiekanaal in dat wordt gebruikt als in een mobiele oriëntatiepuntreferentie. Voer de maximale correctieverschuiving in micrometers in die zijn toegevoegd aan de eerste en laatste Z-positie en klik op OK. Bewaak de huidige driftverschuiving in X, Y en Z in realtime tijdens de beeldacquisitie in het front-end dialoogvenster vivo flow en stop de beeldacquisitie na 35 minuten wanneer een nieuwe cyclus van herinjectie van anesthesie vereist is.

Injecteer een halve dosis van de MMF-mix en start de beeldvormingsacquisitie opnieuw totdat het experiment is voltooid. Deze tool maakt langdurige beeldacquisitie mogelijk, maakt hoogwaardige gegevensverzameling mogelijk en is geschikt voor het volgen van de cellen voor snelheidsmetingen. Zoals getoond zonder driftcorrectie, drijft het interessegebied geleidelijk weg van de opnameweergave, wat van invloed is op de mogelijkheid om cellen te volgen voor snelheidsanalyse.

Stabiele films kunnen echter worden opgenomen met de driftcorrectiesoftware en meer cellen kunnen over een lange periode worden gevolgd. De driftcorrectiesoftware kan ook een visualisatie bieden van de X-, Y- en Z-offsets in de loop van de tijd die door het systeem is gecorrigeerd. Multifotonenmicroscopie biedt een hoge spatiotemporale resolutie voor het volgen van leukocyten, waarbij celmigratiestappen en -snelheid kunnen worden gevolgd en bewaakt.

Door de collaterale vaten voor te bereiden op multifotonenbeeldvorming, is het essentieel om schade aan de collaterale slagaders te voorkomen. Voor beeldvorming is het belangrijk om veilig de juiste collaterale slagader te identificeren. Met deze nieuwe procedure van intravitale multifotonenbeeldvorming van de collaterale slagaders is het mogelijk om de hechting en extravasatie van alle bloedcellen in vivo te analyseren door het antilichaamlabel te wijzigen.