Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Summary

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Abstract

Arteriogenese is sterk afhankelijk van leukocyten- en bloedplaatjesrekrutering naar de perivasculaire ruimte van groeiende collaterale vaten. De standaardbenadering voor het analyseren van collaterale slagaders en leukocyten in arteriogenese is ex vivo (immuno-) histologische methodologie. Deze techniek maakt het echter niet mogelijk om dynamische processen zoals bloedstroom, schuifspanning, cel-celinteracties en deeltjessnelheid te meten. Dit artikel presenteert een protocol om in vivo processen in groeiende collaterale slagaders tijdens arteriogenese te monitoren met behulp van intravitale beeldvorming. De hier beschreven methode is een betrouwbaar hulpmiddel voor dynamische meting en biedt een analyse met hoog contrast met minimale fotocytotoxiciteit, geleverd door multifoton excitatiemicroscopie. Voorafgaand aan het analyseren van groeiende collaterale slagaders, werd arteriogenese geïnduceerd in de adductorspier van muizen door unilaterale ligatie van de dijbeenslagader.

Na de ligatie begonnen de reeds bestaande collaterale slagaders te groeien als gevolg van verhoogde schuifspanning. Vierentwintig uur na de operatie werden de huid en het onderhuidse vet boven de collaterale slagaders verwijderd, waardoor een zak werd geconstrueerd voor verdere analyses. Om de bloedstroom en immuuncellen tijdens in vivo beeldvorming te visualiseren, werden CD41-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (bloedplaatjes) en CD45-fycoerythrine (PE) (leukocyten) antilichamen intraveneus (i.v.) geïnjecteerd via een katheter die in de staartader van een muis werd geplaatst. Dit artikel introduceert intravitale multifotonenbeeldvorming als alternatief of in vivo complementatie voor de veelgebruikte statische ex vivo (immuno-) histologische analyses om processen te bestuderen die relevant zijn voor arteriogenese. Samenvattend beschrijft dit artikel een nieuwe en dynamische in vivo methode om immuuncelhandel, bloedstroom en schuifspanning te onderzoeken in een achterledigmodel van arteriogenese, wat de evaluatiemogelijkheden aanzienlijk verbetert.

Introduction

Ondanks intensieve onderzoeksinteresse in de afgelopen jaren, zijn hart- en vaatziekten, bijvoorbeeld ischemische hartziekten en beroertes, nog steeds de belangrijkste wereldwijde doodsoorzaak¹. Huidige behandelingen voor deze ziekten zijn zeer invasieve therapieën zoals percutane transluminale angioplastiek, percutane transluminale coronaire angioplastiek of bypass-chirurgie². Daarom is de ontwikkeling van alternatieve, niet-invasieve therapeutische opties dringend nodig. Het lichaam kan natuurlijke bypasses rond een gestenoseerd of afgesloten vat creëren om de onderbroken bloedtoevoer naar het distale deel van de stenose om te leiden. Dit proces wordt arteriogenese² genoemd. Veel recente studies hebben aangetoond dat verhoogde vloeistofafschuiving invloed heeft op de rekrutering van leukocyten, die een belangrijke rol speelt tijdens arteriogenese³. De belangrijkste huidige opties om de rekrutering van leukocyten tijdens arteriogenese te analyseren zijn ex vivo (immuno-) histologische analyses of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie⁴. Om de beoordeling van leukocytendynamiek tijdens arteriogenese mogelijk te maken, presenteert dit artikel een intravitaal beeldvormingsprotocol met multifotonenmicroscopie.

Leukocyten zijn de belangrijkste bloedcellen die worden gerekruteerd tijdens het proces van arteriogenese³. Dit protocol maakt gebruik van multifotonenbeeldvorming om het kruipen van adherente leukocyten gelabeld met geïnjecteerde anti-CD45-PE-antilichamen in collaterale slagaders aan te tonen, 24 uur na de inductie van arteriogenese door femorale arterieligatie (FAL) met behulp van een muizenachtermaat ischemiemodel ^5,6. Als alternatief kunnen immuuncellen ex vivo worden gelabeld en zorgvuldig in muizen worden geïnjecteerd, zoals blijkt uit onderzoeken naar angiogenese met behulp van intravitale microscopie⁷. De bloedstroom in bloedvaten en slagaders kan worden gevisualiseerd door CD41-FITC (om bloedplaatjes te labelen), dextran-FITC (plasma) of door de tweede harmonische generatie (SHG), die collageen type 1 visualiseert dat aanwezig is in het keldermembraan van een deel van de vaatboom. SHG is een uniek gratis labelend effect van de multifoton excitatie. Multifotonbeeldvorming maakt langdurige celtracking mogelijk zonder het weefsel te beschadigen en de cellen te activeren door laservermogensexcitatie. Multifotonenmicroscopie is de beeldvormingsmethode bij uitstek voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde cellen en structuren in levende dieren vanwege het vermogen om de fluoroforen dieper in het weefsel / organen te exciteren met minimale fototoxiciteit⁸.

Het gebruik van afgestemde infraroodlasers met pulsen die binnen femtoseconde-intervallen worden afgeleverd, prikkelt het fluorochroom alleen bij het brandpuntsvlak, zonder excitatie boven en onder het brandpuntsvlak⁸. Multifotonenmicroscopie maakt dus een hoge spatio-temporele resolutie, minder fotoschade en verhoogde weefselpenetratiebeeldvorming mogelijk voor het bestuderen van dynamische biologische gebeurtenissen in de organen. Het is een ideaal microscopie-instrument voor beeldvorming van levende dieren. Multifoton en elke andere kunst van intravitale microscopie wordt echter beperkt door weefselbeweging als gevolg van hartslag, ademhaling, peristaltische bewegingen, spiertonaliteit en andere fysiologische functies, die de verwerving en analyse van beeldvorming verstoren. Aangezien deze bewegingen de temporele en ruimtelijke resolutie aantasten en soms zelfs latere analyse verbieden, moeten ze op de juiste manier worden aangepakt om nauwkeurige gegevensanalyse en -interpretatie mogelijk te maken. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om artefacten van weefselbeweging te verlagen of te voorkomen. Dit protocol past een in situ driftcorrectiesoftware genaamd VivoFollow⁹ toe om weefseldrift tijdens beeldacquisitie te corrigeren. Deze aanpak biedt de vereiste beeldstabilisatie, waardoor beeldvorming op lange termijn en celtraceringsanalyse mogelijk zijn.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Beierse Animal Care and Use Committee (goedgekeurd door ethische code: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); deze experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Duitse richtlijnen van de dierwetgeving.

1. Dieren en femorale arterieligatie (FAL)

OPMERKING: Om steriele ontsteking en arteriogenese te induceren, werden 8-10 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen gebruikt. Geen van de muizen stierf of leed aan een wondinfectie of wondgenezingsstoornis tijdens of na de FAL- of schijnoperatie.

1. Anesthesie
   OPMERKING: Vóór injectie van de MMF-mix anesthesie, wordt aanbevolen om eerst te verdoven met 5% isofluraan totdat de muis slaapt.
   1. Weeg de muis en bereid MMF mix met een dosis midazolam 5,0 mg/kg, medetomidine 0,5 mg/kg en fentanyl 0,05 mg/kg.
   2. Vul een spuit van 1 ml met MMF-mix en injecteer een eindvolume van 100 μL s.c. met behulp van een naald van 30 G (na anesthesie met 5% isofluraan).
   3. Plaats de muis op een warm kussen en wacht tot de muis volledig verdoofd is. Stel de timer in op 35 min. Injecteer na deze tijd s.c. de helft van de dosis (50 μl) van het MMF-mengsel.
   4. Controleer de diepte van de anesthesie door het pedaal en de interdigitale reflexen (door stevige teenknijp) van de muis te testen.
      OPMERKING: Een afwezigheid van respons duidt op een voldoende diepte van analgesie.
2. Femorale arterie ligatie (FAL)
   OPMERKING: Gebruik steriele chirurgische instrumenten en hechtingen. Desinfecteer de huid met ontsmettingsmiddel voor opening en na sluiting.
   1. Plaats de verdoofde muis op een verwarmingsplaat (35-37 °C) om de fysiologische lichaamstemperatuur te handhaven. Breng oogcrème (dexpanthenol) aan op elk oog om uitdroging van de ogen onder narcose te voorkomen.
   2. Breng de verdoofde muis over naar een LDI-kamer (Laser Doppler Imaging ) voor en na FAL om de bloedstroom en perfusie te controleren (figuur 1A-C).
   3. Verwijder haar, desinfecteer de huid en maak een snee om toegang te krijgen tot de dijbeenslagader. Onder een chirurgische microscoop ligaat u de rechter dijbeenslagader van de achterpoot van de muis met behulp van een gevlochten zijden hechtdraad (7-0) en voert u een schijnoperatie uit aan de linker dijbeenslagader om te dienen als een interne controle zoals eerder beschreven⁶ (Figuur 1D-K).
      OPMERKING: De incisie in de huid is gemaakt met een kleine schaar om direct letsel aan de bloedvaten dicht bij de huid te voorkomen.
   4. Sluit de huid met een gevlochten zijden hechtdraad (6-0). Dien buprenorfine (0,1 mg/kg) s.c. elke 12 uur toe, beginnend 10 minuten voordat de anesthesie wordt antagoniseerd voor pijnverlichting. Observeer het dier op signalen van pijn, d.w.z. verminderde verzorgingsactiviteit, terughoudendheid om te bewegen of gebogen houding gedurende 24 uur na de operatie.
   5. Injecteer (s.c.) een combinatie van naloxon (1,2 mg/kg), flumazeniel (0,5 mg/kg) en atipamezole (2,5 mg/kg) om de anesthesie te antagoniseren na het beëindigen van de FAL en het sluiten van de huid.
   6. Houd na de operatie de muis op het warme kussen en controleer het dier voortdurend totdat het een rechtopstaande houding kan behouden en normaal rond de kooi kan lopen.
   7. Wanneer de muis volledig wakker is, plaats je hem samen met de andere muizen terug in de kooi en breng je de kooi terug naar de dierenkamer.

2. Weefselvoorbereiding voor multifoton intravitale beeldvorming

1. Staartaderinjectie
   OPMERKING: Het dier moet onder narcose zijn voordat de voorbereiding voor intravitale beeldvorming wordt gestart. Voordat u de naald van de aderkatheter inbrengt, wordt aanbevolen om een huiddesinfectiemiddel op de staart aan te brengen. Dit zal ook helpen om de vaten te visualiseren.
   1. Bereid een staartaderinjectiekatheter voor met behulp van een naald van 2 x 30 G, 10 cm van een polytheenslang met fijne boring (0,28 mm inwendige diameter en 0,61 mm buitendiameter), een spuit van 1 ml en een histoacryllijm om de katheter op de muizenstaart te bevestigen voor verdere i.v.-injecties tijdens beeldvorming (figuur 2A, B en figuur 2F).
   2. Bereid de antilichaamoplossing voor i.v. injectie: CD45-PE en CD41-FITC (20 μg/muis) bij een eindvolume van 100 μL.
   3. Controleer de staart op de zijdelings gelegen staartaders en dam de ader af om de staartader te identificeren. Desinfecteer de staart, breng de aderkatheter in en fixeer deze met tissue histoacryllijm (figuur 2B).
   4. Injecteer de antilichamen vóór de beeldvorming (ten minste 15 minuten voor) en na het beëindigen van het weefselpreparaat.
2. Weefselvoorbereiding
   OPMERKING: Gebruik altijd een warm maandverband en dien een druppel oogcrème (dexpanthenol) toe in elk oog voordat u het weefsel klaarmaakt. Gebruik steriele chirurgische instrumenten en hechtingen. Desinfecteer de huid met ontsmettingsmiddel voor openen en na sluiting.
   1. Plaats de verdoofde muis op een stabiele en draagbare pad. Bevestig de muis in rugligging met een 4-punts fixatie op de pad met plakband (figuur 2B).
   2. Vorm twee stukken boetseerklei en plaats de stukken onder de bovenste achterpoot van de muis om een vlakke positie van de adductorenpier te garanderen (figuur 2B, aangegeven met rode pijlen).
   3. Om een stabiele lichaamstemperatuur van 37 °C van de muis te garanderen, plaatst u de pad met de muis op een verwarmingsplaat onder een chirurgische microscoop met een 0,64-4,0-voudige zoom (figuur 1L).
   4. Verwijder het haar van beide benen, desinfecteer de huid en knip de huid in een cirkel rond het litteken van de eerdere ligatie van de dijbeenslagader van de rechterachterpoot (figuur 1M).
   5. Verwijder de huid en vetlaag van de bovenkant van het been (figuur 1N,O) en trek de resterende huid opzij met behulp van hechtingen om een zak rond de adductorenpier te creëren (figuur 1P,Q).
   6. Verwijder onderhuids vet om een duidelijk zicht te krijgen op de adductorspier en de diepe slagader / ader, evenals de collaterale vaten (figuur 1Q, R).
   7. Begin voorzichtig met het verwijderen van de oppervlakkige spierlaag bovenop de collaterale vaten door deze voorzichtig te ontleden met een fijne tang (figuur 1R).
      OPMERKING: De collaterale slagader en de collaterale ader zijn duidelijk zichtbaar en klaar voor beeldvorming (figuur 1S).
   8. Vul de voorbereide zak met zoutoplossing om uitdroging van het weefsel te voorkomen en ga verder met dezelfde procedure voor de schijn-geopereerde linkerachterpoot. Voeg voor het fotograferen ultrasone gel toe in beide zakken, die uitdroging voorkomt en dient als een onderdompelingsmedium voor optische koppeling met het doel (figuur 2C en figuur 2F).

3. Intravitale multifotonenmicroscopie

1. Voorbereiding
   OPMERKING: Bewaar een spuit met ultrasone gel in de couveusekamer van de microscoop om een warme temperatuur te behouden voor het bijvullen van de zakken tijdens langdurige beeldvorming.
   1. Verwijder de zoutoplossing uit de twee voorbereide zakken en vervang deze door ultrasone gel om de collaterale vaten te bedekken (figuur 2C).
   2. Injecteer de antilichaamoplossing via de staartaderkatheter. Breng 15 minuten na de injectie van het antilichaam de pad met de vaste muis over in de verwarmde multifotonenbeeldkamer (figuur 2F).
   3. Na voltooiing van de beeldacquisitie, euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder diepe narcose.
2. Multifoton microscopie beeldacquisitie
   OPMERKING: Zet de microscoop 30 minuten voor de beeldvorming aan om laserstabilisatie mogelijk te maken. Voor de beste optische stabiliteit van de microscoop wordt aanbevolen om de microscoopkamer permanent verwarmd te houden.
   1. Schakel de sleutel van de Ti:Sapphire-laserbox, de elektronische interfaceboxen, de verwarmingseenheid van de incubatiekamer, de fluorescentielamp en de computer in (figuur 2D, E).
   2. Start de acquisitiesoftware (Inspector-software). Stel de golflengte in op 800 nm en open de sluiter van de microscoop (figuur 3A ii).
   3. Kies in het dialoogvenster Wizard Meting de instrumentmodus (enkele bundel) en in de meetmodus (3D-scan Time lapse) (figuur 3A i).
   4. Breng de verdoofde muis over in de voorverwarmde incubatiekamer van de microscoop. Plaats het gebied met de ultrasone gel (stap 2.2.8) direct in contact met de objectieve frontlens (figuur 2F).
   5. Open de sluiter van de epifluorescentiemicroscoop, kies een geschikte filter/dichroïsche instelling voor FITC-visualisatie (4) om het interessegebied te vinden door de bloedstroom onder epifluorescentieverlichting te volgen. Nadat u het interessegebied in het middelste gezichtsveld hebt gebracht, sluit u de epifluorescentiemicroscoopsluiter.
   6. Stel in het dialoogvenster xy-Scanner de volgende parameters in: Afbeeldingsgrootte (554x554), Pixel (512x512), Frequentie (400), Lijngemiddelde (1) (Figuur 3A iii). Pas het laservermogen (5%) aan (figuur 3A iv) en stel de versterking van de fotomultiplicator (PMT) in voor de kanalen groen (66), rood (66) en blauw (63) (figuur 3A v).
   7. Selecteer een adequaat objectief voor instellingen voor intravitale beeldvorming en driftcorrectie (zie details in 3.2.11).
      OPMERKING: Hier was het geselecteerde objectief de Nikon LWD 16x (Figuur 3A vi).
   8. Definieer het afbeeldingsstapelbereik door de voorbeeldacquisitiemodus te starten door op de rode knop in de rechterbovenhoek van het dialoogvenster Wizard Meting te drukken (afbeelding 3A i).
   9. Definieer het gebied en de structuur van belang door scherp te stellen om een goed beeld te verkrijgen. Verander vervolgens, terwijl u het scherm observeert, de focus door het objectief omhoog te bewegen totdat het beeld verdwijnt en stel het in op nul (eerst = 0). Verander de focus in de tegenovergestelde richting door het objectief naar beneden te bewegen totdat het beeld weer van het scherm verdwijnt en stel het in als de laatste (end = 40 μm) positie in de axiale richting (figuur 3A vii).
   10. Stel de stapgrootte in op 2 μm. Klik op de rode knop in de rechterbovenhoek van het dialoogvenster Wizard Meting om het scannen van de voorvertoning te stoppen.
       OPMERKING: Het aantal afbeeldingen wordt automatisch berekend en ingesteld (21 afbeeldingen), zoals aangegeven in figuur 3A vii.
   11. Als de microscoop is uitgerust met live-driftcorrectie⁹, start u de driftcorrectiesoftware (bijv. VivoFollow) en volgt u de onderstaande stappen.
       1. Kies in het dialoogvenster Wizard Meting de Python-as (Python-ax) (afbeelding 3A viii) als het eerste asapparaat; Activeer de automatische opslagmodus NIET. Schakel het selectievakje voor automatisch opslaan (AS) alleen in op de tijdas ( Tijdtijd). Druk op het Python-pictogram in het venster Beschikbare apparaten (afbeelding 3A ix) om het dialoogvenster Python te openen.
       2. Voer in het dialoogvenster Python Axis-instellingen de invoer in From (0 zero) en To (-40). Voer het aantal stappen (21) in zoals aangegeven in figuur 3A x.
       3. Ga naar het dialoogvenster xyz Stage Z en vergroot het scanbereik aan beide uiteinden met 200 μm: in Start voert u in (200 μm) en in End (-240 μm) wordt het bereik automatisch ingesteld (-440 μm). Houd de stapgrootte (2 μm) aan zoals weergegeven in figuur 3A xi.
       4. Open het dialoogvenster VivoFollow Frontend en klik op het vak Bewegingsprofiel (Figuur 3A xii).
       5. Start de beeldacquisitie door op de groene pijlpunt in de linkerbovenhoek van het dialoogvenster Meetwizard van de inspecteursoftware te drukken (figuur 3A i).
       6. Als live-driftcorrectie wordt gebruikt, zoekt u naar een dialoogvenster waarin de driftcorrectieconfiguratie wordt weergegeven zoals weergegeven in figuur 3A xiii. Stel het acquisitiekanaal in dat zal worden gebruikt als een immobiele oriëntatiepuntreferentie (kies voor dit protocol kanaal 2, waar het vasculaire tracersignaal moet worden opgenomen). Voer de maximale correctieverschuiving in μm in die is toegevoegd aan de eerste en laatste z-positie (hier 200 μm) en klik op OK.
       7. Bewaak de huidige verschuiving van de drift in x, y en z in realtime tijdens de beeldacquisitie in het VivoFollow-dialoogvenster met voorkant Figuur 3A xiv.
       8. Stop de acquisitie van beeldvorming na ~ 35 minuten wanneer een andere cyclus van herinjectie van anesthesie nodig is. Injecteer een halve dosis van de MMF-mix (50 μl s.c.) en start de beeldvorming opnieuw door nogmaals op de groene pijlpunt te drukken (stap 3.2.11.5).
       9. Herhaal deze procedure totdat het experiment is voltooid.

Representative Results

Multifotonenmicroscopie biedt een hoge spatio-temporele resolutie voor het volgen van leukocyten, waarbij celmigratiestappen en -snelheid kunnen worden gevolgd en gecontroleerd (figuur 4A, B). De fysiologische beweging van het monster vormt echter een uitdaging, vooral voor langdurige intravitale microscopie-beeldacquisities. Daarom zijn een goed weefselpreparaat en houders om het weefsel te fixeren en hulpmiddelen, zoals real-time beeldcorrectie voor weefseldrift, vereist voor succesvolle en stabiele beeldvormingsacquisitie. Hier werd een live-drift-tool, VivoFollow, gebruikt om te corrigeren voor de weefseldrift die wordt gegenereerd tijdens langetermijnbeeldvormingsacquisitie.

De toepassing van deze tool maakt langdurige beeldacquisitie mogelijk en maakt het mogelijk om gegevens van hoge kwaliteit te verzamelen, geschikt voor het volgen van cellen voor snelheidsmetingen. Zoals te zien is in figuur 3B, zonder driftcorrectie, drijft het interessegebied geleidelijk weg van de opnameweergave, wat van invloed is op de mogelijkheid om cellen te volgen voor snelheidsanalyse. Zoals te zien is in figuur 3C, kunnen met de driftcorrectiesoftware stabiele films worden opgenomen en kunnen meer cellen gedurende een lange periode worden gevolgd. De driftcorrectiesoftware kan ook een visualisatie bieden van de x-, y- en z-verschuivingen in de loop van de tijd waarvoor het systeem is gecorrigeerd, zoals weergegeven in figuur 3D.

Figuur 1: Laser Doppler Imaging setup en voorbereiding voor femorale arterieligatie en weefselvoorbereiding voor intravitale beeldvorming. (A) LDI-beeldvorming. (B) De muis wordt in de LDI-warmhoudkamer geplaatst voor beeldacquisitie. (C) LDI-beelden van het rechter- en linkerbeen vóór (bovenpaneel) en na FAL (onderste paneel) om de achterpootperfusie na ligatie te controleren. De rechter dijbeenslagader was geligeerd/afgesloten, terwijl de linker dijbeenslagader schijngeopereerd was (Sham) en diende als interne controle. In de kleurenbalk duidt blauw op een lage bloedperfusie en rood op een hogere perfusie. (D-K) Afbeeldingen vertegenwoordigen de operatiestappen van de femorale arteriële ligatie. Schaalbalk = 10 mm. (L-S) Weefselpreparaat voor intravitale beeldvorming na FAL. Het af te beelden gebied wordt aangegeven door de zwarte cirkel, waar de collaterale vaten zich bevinden. Schaalbalk = 5 mm. Afkortingen: LDI = Laser Doppler imaging; FAL = ligatie van de dijbeenslagader; Occ = occlusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Opstelling voor multifoton intravitale beeldvorming. (A) Voorbereiding van aderkatheters; 1-Fijne polytheen slang van 10 cm, 2: 2x 30 G naald; 3: gemonteerde katheter verbonden met 1 ml spuit; 4: weefsel histoacryl lijm; 5: naaldhouder. (B) De muis in rugligging geplaatst met beide achterpoten geplaatst op stukken zwarte boetseerklei (rode pijlen) voorbereid voor beeldvorming. (C) Occluded (Occ) rechter achterpoot en linker, schijn-geopereerde achterpoot klaar voor beeldvorming. (D) Multifotonenmicroscoopopstelling met laserdozen, fluorescentielampdoos, buizen voor het verwarmen van de incubatorkamer. (E) Incubatorkamer van de multifotonenmicroscoop. (F) Muis geplaatst in de microscoopkamer met het 16x objectief dat het weefsel bedekt met ultrasone gel raakt. Detail van de aderkatheter die op de staartader is bevestigd voor injectie van antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: VivoFollow drift correctie software setup. (A) (i-xiv) Stappen voor het instellen van software zoals beschreven in protocolstap 3.2.2-3.2.11.9. (B) Representatieve tijdreeksbeelden waarop te zien is dat de beeldvorming afdrijft zonder dat de driftcorrectiesoftware is ingeschakeld. De collaterale slagader wordt begrensd door de witte opgeheven lijnen (Video 1 en Video 2). (C) Representatieve tijdreeksbeelden die de stabiele tijdreeksen weergeven wanneer de live driftcorrectie wordt toegepast tijdens de beeldvorming. Leukocyten werden gelabeld met CD45-PE-antilichamen (rood), bloedplaatjes werden gelabeld met CD41-FITC-antilichamen (groen) en collageen type 1 met de SGH (blauw). De collaterale slagader wordt begrensd door de witte opgeheven lijnen. (D) Lijndiagram met de live correctie langs x-, y- en z-richtingen. Afkortingen: PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; SGH = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten . (A) Leukocytensnelheden gemeten in collaterale slagaders van sham-geopereerde (Sham) en femorale arterie-geligeerde achterpoten. (B) Representatieve afbeeldingen tonen de cellen gevolgd (magenta) met de sporen kleurgecodeerd. De kleurcodebalk vertegenwoordigt de celsnelheid met de langzamere cellen die worden weergegeven door blauwe tracks en snellere cellen met rode tracks. Leukocyten werden gelabeld met geïnjecteerde CD45-PE-antilichamen (rood), bloedplaatjes werden gelabeld door geïnjecteerde CD41-FITC-antilichamen (groen) en het collageen type 1 met de SGH (blauw). Resultaten van drie afzonderlijke experimenten. Schaalbalk = 20 μm. Zie Video 3 en Video 4. Afkortingen: Occ= occluded/femoral artery-ligated; PE = fycoerythrin; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; SGH = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Multifoton intravitale beeldvorming van een collaterale slagader zonder driftcorrectie. Vierdimensionale beelden werden opgenomen met een pixelgrootte van 554 x 554 μm, frequentie 600 Hz, een interval van 1100 ms/frame, stapgrootte van 2 μm en bereik van 40 μm. De video toont het beeld dat afdrijft zonder de toepassing van de VivoFollow-driftcorrectiesoftware. De collaterale slagader wordt getoond in het onderste deel van de video en de collaterale ader verschijnt na 3 minuten in het bovenste deel van de film. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Multifoton intravitale beeldvorming van een collaterale slagader met toegepaste driftcorrectie. Er werden vierdimensionale beelden gemaakt met een pixelgrootte van 554 x 554 μm, frequentie 600 Hz, een interval van 1100 ms/frame, stapgrootte van 2 μm en bereik van 40 μm. De video is opgenomen met de live driftcorrectiesoftware VivoFollow en toont de beeldstabiliteit die wordt bevorderd door de driftcorrectiesoftware toe te passen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Cell-tracking imaging in een collaterale slagader na schijnoperatie. Leukocyten gelabeld met geïnjecteerde anti-CD45-PE-antilichamen werden afgebeeld in een rustende collaterale slagader van het schijnbeen en gevolgd met behulp van Imaris-software met de plug-in voor het volgen van cellen. Bijgehouden cellen werden geselecteerd en weergegeven door de magenta-stippen. De sporen waren kleurgecodeerd op basis van de celsnelheid. Langzamere cellen worden weergegeven door blauwe sporen en snellere cellen door rode sporen. Schaalbalk = 50 μm. Afkorting = PE = phycoerythrin. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Cell-tracking imaging in een collaterale slagader na FAL. Leukocyten gelabeld met anti-CD45-PE-antilichamen werden 24 uur na de inductie van arteriogenese door FAL in beeld gebracht in een groeiende collaterale slagader en gevolgd met behulp van Imaris-software met de plug-in voor het volgen van cellen. Bijgehouden cellen werden geselecteerd en weergegeven door de magenta-stippen. De sporen waren kleurgecodeerd op basis van de celsnelheid. Langzamere cellen worden weergegeven door blauwe sporen en snellere cellen door rode sporen. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: FAL = femorale arterieligatie; PE = fycoerythrin. Klik hier om deze video te downloaden.

Technische problemen	Voorgestelde oplossingen
In het geval dat de staartvaten niet zichtbaar zijn voor het inbrengen van de katheter	• Gebruik een warm kompres rond de muizenstaart gedurende 3-5 minuten om lokale vaatverwijding te bevorderen. Het zal helpen om de ader zichtbaar te maken.
In het geval dat de staartkatheter niet kan worden gefixeerd voor antilichaaminjectie	• Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 30 G om in de ader te brengen en injecteer de antilichamen en kleurstoffen direct voordat u beeldvorming uitvoert.
	• In sommige gevallen (afhankelijk van de antilichamen) kan de injectie i.p. 1 uur voor de beeldvorming worden aangebracht.
Wanneer de beweging van weefsel de stabiliteit van de beeldvorming belemmert	• Probeer het bovenste hintbeen van de muis opnieuw te positioneren en opnieuw te fixeren om de fysiologische buikbewegingen te voorkomen.
	• Controleer of de microscooptafel voldoende lucht heeft om trillingen te onderdrukken.
	• Zorg ervoor dat de muis in diepe anesthesie is en niet wakker wordt.
	• Controleer de ademhaling van de muis. Wanneer de muis te snel ademt, kan dit een impact hebben op de beeldvormingsbeweging.
Wanneer de beeldkwaliteit begint af te nemen	• Zorg ervoor dat de ultrasone gel niet uitdroogt.
	• Vul de ultrasone gel opnieuw.
	• Zorg ervoor dat het doel schoon is (reinig de gedroogde ultrasone gel op het objectief wanneer een nieuwe vulling wordt gedaan).
Wanneer de slagaders beschadigd zijn tijdens de voorbereiding voor beeldvorming	• In dit geval is het niet mogelijk om afbeeldingen te verkrijgen. Het is niet mogelijk om het experiment uit te voeren.

Tabel 1: Problemen oplossen.

Discussion

De beschreven methode van multifoton in vivo analyse van leukocytenrekrutering vormt een aanvulling op veelgebruikte hulpmiddelen voor leukocytenrekruteringsstudies zoals (immuno-) histologische of FACS-analyses. Met deze beeldvormingsmethode is het mogelijk om de dynamische processen in leukocytenaanhechting en extravasatie tijdens arteriogenese in meer detail te visualiseren¹⁰. Ondanks de toegevoegde waarde van deze methode, bevat het aangeboden protocol enkele kritieke stappen en beperkingen. Zie tabel 1 voor meer tips voor het oplossen van problemen. Tijdens het verwijderen van de oppervlakkige spierlaag op collaterale slagaders kunnen deze slagaders beschadigd raken en zullen ze niet nuttig zijn voor intravitale beeldvorming. De katheter moet goed gefixeerd zijn voor antilichaaminjectie; Anders kan het uitglijden van de staartaderkatheter de extravasatie van de antilichamen in de perivasculaire ruimte van de staart veroorzaken, waardoor vervanging en extra correctie voor injectie van de antilichamen een uitdagende taak wordt. De juiste identificatie van de collaterale slagader en de collaterale ader tijdens intravitale microscopie vertegenwoordigt een andere kritieke stap van dit protocol.

Aangezien de muis niet mechanisch wordt beademd tijdens intravitale microscopie, is de dynamische beeldvormingstijd beperkt om lichamelijk letsel aan de muis als gevolg van te lange anesthesie te voorkomen. Een van de tekortkomingen van intravitale microscopie is de fysiologische beweging van de muis, gegenereerd door ademhaling, hartslag en peristaltische bewegingen, die van invloed kunnen zijn op de beeldacquisitie en dus op de kwaliteit van gegevensanalyses. Het verbeteren van weefselhouders, montage en fixatie zijn stappen die de effecten van beweging verder verminderen. Naast de fysiologische beweging kan beeldvorming op lange termijn bijdragen aan het afdrijven van weefsel tijdens beeldvorming. Zoals beschreven in dit protocol, werd een real-time weefseldriftcorrectiesoftware, VivoFollow, gebruikt om beeldvormingsgegevens te verkrijgen die geschikt zijn voor daaropvolgende celtracking en celsnelheidsanalyse. Deze VivoFollow-software corrigeert voor de monsterverplaatsing in x, y en z direct tijdens beeldacquisitie. Het is afhankelijk van immobiele anatomische structuur, bijvoorbeeld wanneer vaten worden gevisualiseerd met vasculaire tracers die dienen als referentiepunten voor de correctieprocedure.

Hoewel er andere post-acquisitie driftcorrectietools beschikbaar zijn, zoals die binnen Bitplane Imaris of plug-ins voor ImageJ, zijn ze zeer beperkt in hun capaciteit voor correctie omdat ze geen herstel van het interessegebied mogelijk maken. In principe kunnen ze niet corrigeren voor ernstige compensaties wanneer het interessegebied zich buiten het gezichtsveld beweegt. Dit protocol kan echter zelfs worden toegepast wanneer de live-driftcorrectie niet beschikbaar is en correctie na acquisitie noodzakelijk wordt. Dit vereist echter frequente training van personeel in weefselmontage en fixatie. Kortom, multifoton intravitale microscopie is een nuttige dynamische methode die parallel kan worden toegepast met statisch gevestigde methoden zoals (immuno-) histologische analyses om een meer gedetailleerd beeld te krijgen van de dynamische componenten van leukocytenrekrutering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9