Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den Prozess der Arteriogenese in vivo zu analysieren, indem sie die Adhärenz und Extravasation von Immunzellen in wachsenden Kollateralarterien in Echtzeit verfolgen. Die Multiphotonenmikroskopie-Technik ermöglicht die Visualisierung der Zelldynamik im tiefen Gewebe lebender Mausmodelle mit geringer Phototoxizität und hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Das mikroskopische Verfahren wird von Dominic van den Heuvel, einem technischen Assistenten der Multiphotonen-Bildgebungsplattform aus dem Labor von Dr. Helen Ishikawa-Ankerhold, demonstriert.

Ich werde den chirurgischen Eingriff demonstrieren. Legen Sie die betäubte Maus zunächst in Rückenlage. Legen Sie dann zwei Stücke geformten Ton unter die obere Hintergliedmaße der Maus, um eine ebene Position des Adduktorenmuskels zu gewährleisten.

Legen Sie die Maus unter das Stereomikroskop. Nachdem Sie die Haare von beiden Beinen entfernt haben, desinfizieren und schneiden Sie die Haut kreisförmig um die Narbe der früheren Oberschenkelarterie der rechten Hintergliedmaße. Entfernen Sie die Haut- und Fettschicht von der Oberseite des Beins und ziehen Sie die restliche Haut mit Nähten beiseite, um eine Tasche um den Adduktorenmuskel mit den Seitengefäßen zu schaffen.

Als nächstes entfernen Sie das Unterhautfett, um eine klare Sicht auf den Adduktorenmuskel, die Arteria profunda und die Vene profunda sowie die Seitengefäße zu erhalten. Entfernen Sie die oberflächliche Muskelschicht auf den Seitengefäßen mit einer feinen Pinzette. Füllen Sie die vorbereitete Tasche mit Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, und fahren Sie mit dem gleichen Verfahren für die scheinoperierte linke Hintergliedmaße fort.

Geben Sie vor der Bildgebung Ultraschallgel in beide Taschen, das ein Austrocknen verhindert und als Immersionsmedium für die optische Kopplung mit dem Objektiv dient. Schalten Sie den Schlüssel der Titan-Saphir-Laserbox, der Box für elektronische Schnittstellen, der Heizeinheit der Inkubatorkammer, der Leuchtstofflampe und des Computers ein. Starten Sie die Erfassungssoftware.

Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 Nanometer ein und öffnen Sie den Verschluss des Mikroskops. Wählen Sie im Dialog des Messassistenten den Gerätemodus als Einzelstrahl und den Messmodus als 3D-Scan-Zeitraffer aus. Anschließend wird die anästhesierte Maus in die vorgewärmte Inkubationskammer des Mikroskops überführt und der Bereich mit dem Ultraschallgel direkt in Kontakt mit der Objektivfrontlinse positioniert.

Öffnen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops. Wählen Sie dann einen geeigneten Filter oder eine dichroitische Einstellung für die FTSE-Visualisierung. Definieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie den Blutfluss unter Epifluoreszenzbeleuchtung verfolgen.

Nachdem Sie den interessierenden Bereich in das mittlere Sichtfeld gebracht haben, schließen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops. Stellen Sie im Dialogfeld XY-Scanner die erforderlichen Parameter für Bildgröße, Pixel, Frequenz und Liniendurchschnitt ein. Passen Sie die Laserleistung an und stellen Sie die Verstärkung des Fotomultiplikators für die Kanäle Grün, Rot und Blau ein.

Wählen Sie ein geeignetes Objektiv für die intravitale Bildgebung und die Einstellungen für die Driftkorrektur. Definieren Sie den Bildstapelbereich, indem Sie den Vorschauaufnahmemodus starten, indem Sie die rote Taste im Dialogfenster des Messassistenten drücken. Um gute Bilder zu erhalten, definieren Sie den Bereich und die Struktur des Interesses durch Fokussieren.

Ändern Sie während der Beobachtung des Bildschirms den Fokus, indem Sie das Objektiv bewegen, bis das Bild verschwindet, und stellen Sie es auf Null ein. Stellen Sie die Objektivposition als letzte Position in axialer Richtung ein. Ändern Sie dann den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie das Objektiv nach unten bewegen, bis das Bild wieder vom Bildschirm verschwindet.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp in der oberen linken Ecke des Dialogfelds des Messassistenten und stellen Sie die Schrittweite auf zwei Mikrometer ein. Wählen Sie die Python-Achse als erstes Achsgerät im Dialogfeld des Messassistenten aus und wählen Sie den Auto-Save-Modus nicht aktivieren. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen zum automatischen Speichern nur auf der Zeitachse.

Klicken Sie anschließend auf das Python-Symbol im Fenster “Verfügbare Geräte”, um das Python-Dialogfenster zu öffnen. Geben Sie in den Achseneinstellungen des Python-Dialogfelds die Abschnitte “von” und “bis” ein und geben Sie dann die Anzahl der Schritte ein. Rufen Sie das Dialogfenster XYZ-Stufe Z auf und vergrößern Sie den Scanbereich an beiden Enden um 200 Mikrometer.

Geben Sie dazu 200 Mikrometer in start und minus 240 Mikrometer in end ein und der Bereich wird automatisch auf minus 440 Mikrometer eingestellt. Öffnen Sie den VivoFollow-Frontend-Dialog. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die grüne Pfeilspitze in der oberen linken Ecke des Dialogfelds des Messassistenten drücken.

Wenn die Live-Driftkorrektur verwendet wird, suchen Sie nach einem Dialogfeld, in dem die Konfiguration der Driftkorrektur angezeigt wird. Legen Sie dann den Erfassungskanal fest, der wie in einer mobilen Landmarkenreferenz verwendet wird. Geben Sie den maximalen Korrekturversatz in Mikrometern ein, der zur ersten und letzten Z-Position addiert wird, und klicken Sie auf OK. Überwachen Sie den aktuellen Drift-Offset in X, Y und Z in Echtzeit während der Bildaufnahme im vivo flow-Frontend-Dialogfenster und stoppen Sie die Bildaufnahme nach 35 Minuten, wenn ein weiterer Zyklus der Anästhesie-Reinjektion erforderlich ist.

Injizieren Sie eine halbe Dosis der MMF-Mischung und starten Sie die Bildaufnahme neu, bis das Experiment abgeschlossen ist. Dieses Tool ermöglicht eine langfristige Bildaufnahme, ermöglicht eine qualitativ hochwertige Datenerfassung und eignet sich zum Tracking der Zellen für Geschwindigkeitsmessungen. Wie ohne Driftkorrektur gezeigt, driftet der interessierende Bereich zunehmend von der Aufzeichnungsansicht weg, was sich auf die Fähigkeit auswirkt, Zellen für die Geschwindigkeitsanalyse zu verfolgen.

Mit der Driftkorrektur-Software können jedoch stabile Filme aufgezeichnet und mehr Zellen über einen langen Zeitraum verfolgt werden. Die Driftkorrektursoftware kann auch eine Visualisierung der X-, Y- und Z-Offsets im Laufe der Zeit bereitstellen, die vom System korrigiert wurden. Die Multiphotonenmikroskopie bietet eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung für die Leukozytenverfolgung, wobei Zellmigrationsschritte und -geschwindigkeiten verfolgt und überwacht werden können.

Durch die Vorbereitung der Kollateralgefäße für die Multiphotonen-Bildgebung ist es wichtig, eine Schädigung der Kollateralarterien zu vermeiden. Vor der Bildgebung ist es wichtig, die richtige Kollateralarterie sicher zu identifizieren. Mit diesem neuen Verfahren der intravitalen Multiphotonen-Bildgebung der Kollateralarterien ist es möglich, die Adhärenz und Extravasation aller Blutzellen in vivo durch Änderung der Antikörpermarkierung zu analysieren.