Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד
Chapters
Summary November 4th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
השימוש הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים כדי לבודד תאים חיידקיים על ידי שימוש בכלי טפיחה אור ברזולוציה גבוהה מדווח. נהלים ניסיוניים חיוניים, תוצאות ויתרונות של התהליך נבדקים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וזול של חיידקים ממוקדים המציגים פונקציות נדירות או ייחודיות מקהילות או אוכלוסיות הטרוגניות.
Transcript
פרוטוקול זה נועד לבודד במהירות תאים מממשקי סינון עבור אפיון גנומי ויכולת זו היא משמעותית מכיוון שהיא יכולה לשלב תכונות תאים הניתנות לצפייה מקרוסקופית עם מידע גנומי. ניתן לבודד את תאי החיידקים הממוקדים מממשקי ההקרנה עם מיקום מרחבי גבוה באופן פשוט מבחינה תפעולית באמצעות טכניקה זו. הידרוג'ל יכול להיות מיושם בממשקי הקרנה אחרים.
חומר הידרוג'ל יכול להיות משולב בקלות לתוך ערוצים microfluidic לאחזור לפי דרישה של תאים ממכשירים microfluidic. התחל על-ידי חנק המאגר המקשר באמצעות צפיפות התא הרצויה. הכן את פתרון המבשר הידרוג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של המאגר המקשר ו-5.6 מיקרוליטרים של פתרון ניקוד PEG ONB.
ולבסוף, להוסיף 6.9 microliters של תמיסת PEG תיול זרוע האמה לתערובת. לתמצית תאים בתמיסת המבשר ההידרוג'ל, הניחו את כיסויי הבסיס התיאולה על צלחת פטרי נקייה והצבנו שני מרווחים משני הצדדים המנוגדים של כיסוי הכיסוי. תקן את המרווחים על מכסה הבסיס על ידי הדבקת המרווחים לצלחת פטרי.
לאחר הוספת הנפח הרצוי של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated לא תגובתי, מניחים את השקופית על כיסוי הבסיס ומאפשרים להיווצרות הידרוג'ל להשלים בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות. לאחר השלמת הג'ל, הסר בעדינות את שקופית הזכוכית perfluoroalkated. מניחים את המצע בצלחת פטרי 60 על 15 מ"מ המכילה מדיה ATGN בתוספת אנטיביוטיקה.
זרע 700 מיקרוליטרים של השעיות תאים חיידקיים עם OD 600 של 0.1 מעל מצע מערך microwell ולהפוך את פתרון הקדמה הידרוג'ל כפי שהודגם בעבר באמצעות 12.5 microliters של פוספט חוצץ ATGN של pH שמונה. Pipette 12.5 מיקרוליטרים של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated ללא תגובתי ומניחים שני מרווחי פלדה 38 מיקרומטר על שני צדדים מנוגדים של מערך microwell מצע innoculated עם תאים. לאחר מכן הפוך את שקופית הזכוכית perfluoroalkated עם טיפת פתרון מבשר ולהניח טיפה באמצע המצע microwell.
כאשר הידרוג'ל נוצר לאחר דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בעדינות את שקופית הזכוכית מן המצע microwell ומניחים את המצע בצלחת פטרי המכילה מדיה ATGN בתוספת אנטיביוטיקה. מקם את הדגימה במחזיק PDMS והוסף את המדיה המוגדרת מעל המדגם כדי למנוע התייבשות מדגם ולספק פתרון מוביל לתאים שפורסמו. לאחר הבאת מראה הכיול למיקום, להתאים את מיקוד המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה חדה של המושבות בתוך מערך הידרוג'ל או microwell ולבדוק כדי לזהות מושבות או בארות עניין.
כאן, עצב את דפוסי האור בזמן שתצוגת המצלמה מציגה את המושבות בתוך המדגם כדי לבדוק דפוסים שונים להפקת תאים ולשמור את התבנית המוגדרת. לאחר מכן בחר את מקטע בקרת ההפעלה, הוסף את הרצף השמור תחת הכרטיסיה שכותרתה בשם המוצר של כלי התאורה בדוגמת המילוי. בחר באפשרות לגרות את התבנית כדי להציג ולהתאים את מיקום החשיפה הרצוי.
לאחר מכן, התאם את עוצמת האור ל- 60% ואת זמן החשיפה ל- 40 שניות תחת הכרטיסיה בקרת LED והתחל את תהליך החשיפה. נטר את השפלת ההידרוג'ל בזמן אמת ומצב ברייטפילד כדי להבטיח את שחרור התא. כדי לאסוף את התא ששוחרר, שנה את מסנן המיקרוסקופ מברייטפילד ל- TRITC כדי לדמיין את האזור החשוף של המדגם בעין בלתי.
לאחר שהאזור החשוף ממוקם, הנח את קצה הצינורות על הנקודה המוקרנת, ולאחר מכן שנה את מסנן המיקרוסקופ בחזרה לברייטפילד כדי לפקח על אחזור התא בזמן אמת. השתמש במזרק המחובר לקצה השני של הצינורות כדי למשוך בזהירות 200 מיקרוליטרים של פתרון המכיל את התאים המשוחררים ולהעביר את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"מ לניתוח DNA או ציפוי. דפוסי מיקרו אור UV שונים שימשו להפקת תאים הידרוג'ל בתפזורת, אשר השפיעו על המורפולוגיה של התאים ששוחררו.
החשיפה לקרינת UV בתבנית טבעת הביאה לשחרור המושבה כולה עטופה בהידרוג'ל PEG מגן. לעומת זאת, על ידי חשיפת חלק או כל המושבה לאור UV, תאים יכולים להיות מופקים או כצביר תאים מצטברים או כתאים בודדים חופשיים. צפיפות זריעת התא ועובי ההידרוג'ל חשובים לתמצית תאים.
ההידרוגלים הדקים יותר גרמו למושבות מיקרו עם חפיפה מינימלית של המושבה, בעוד ההידרוג'לים בעובי מוגבר גרמו למושבות חופפות, מה שעלול לגרום להפקת מושבות מרובות. מושבות חופפות יכולות לגרום לזיהום צולב במהלך החילוץ בשל האופי הדו מימדי של תבנית האור. כאשר מושבה עליונה סומנה כמטרה, המושבה הבסיסית חולצה גם איתה.
ההשפעה של דפוסי מיקרו אור UV מגוונים על הכדאיות התא הוערך גם. כאשר מושבות מיקרו נחשפו למינונים מבוקרים של אור UV בתבנית מעגלית או צולבת, התאוששות התאים וטוהר ה- DNA לא הושפעו. התאים אוחזרו בהצלחה מערכי מיקרווול באמצעות גישה זו, אשר ניכרה מתמונות המיקרוסקופיה הקונפוקלית הייצוגית, שם לאחר ההקרנה בתבנית המעגלית והטבעת, התאים הוסרו בתבנית המתאימה.
לאחר החילוץ מערכי microwell, הכדאיות התא וכמות ה- DNA הוערכו. דפוסי החשיפה לא השפיעו על ספירת התאים בת קיימא ולא על איכות הדנ"א, מה שמצביע על כך שניתן לאחזר באופן סלקטיבי תאי חיידקים בני קיימא ממיקרווולים עם נזק מינימלי, והדנ"א שלהם יכול להיות מבודד בטוהר גבוה לניתוח גנומי במורד הזרם. תמיד לבדוק כי הידרוג'ל נוצר לפני הסרת כיסוי perfluoroalkated.
דיוק וטיפול נדרשים להצבת המרווחים לתצהיר הידרוג'ל ושימוש בצינורות להפקת תאים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
