एक्स वीवो मिडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से लेटरल एंटोरिनल कॉर्टेक्स तक लंबी दूरी के सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी की ऑप्टोजेनेटिक पूछताछ

वायरल रूप से वितरित ऑप्टोजेनेटिक संरचनाएं तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में विशिष्ट सिनैप्स के शरीर विज्ञान और प्लास्टिसिटी के विस्तृत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं। सिनैप्स ऑप्टोजेनेटिक रूप से सक्रिय करने के प्राथमिक फायदे लंबी दूरी के मार्गों का अध्ययन करने की क्षमता है, और अक्षतंतु की चयनात्मक उत्तेजना जो शारीरिक रूप से अलग नहीं हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन हमारी प्रयोगशाला के एक शोध सहयोगी डॉ लिसा किन्नावाने करेंगे।

शुरू करने के लिए, एक हैमिल्टन सिरिंज को एक माइक्रोइंजेक्शन सिरिंज पंप में लोड करें जो स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर लगे एक जंगम हाथ से जुड़ा हुआ है। फिर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में वायरस का पांच-माइक्रोलीटर एलिकोट रखें। ट्यूब को कुछ सेकंड के लिए घुमाएं और वायरल तैयारी के दो माइक्रोलीटर को ट्यूब के ढक्कन में घुमाएं।

वायरल तैयारी के साथ सिरिंज को भरने के लिए, सुई की नोक को सर्जिकल माइक्रोस्कोप से देखें। फिर मैन्युअल रूप से सुई की नोक पर वायरस के बोलस रखें, और पंप नियंत्रण का उपयोग करके सिरिंज प्लंजर को वापस लें। पंप इंजेक्शन वॉल्यूम को 300 नैनोलीटर और प्रवाह दर को 100 नैनोलीटर प्रति मिनट पर सेट करें।

पंप चलाएं और सुई की नोक पर वायरस की बूंद को देखकर उचित प्रवाह की पुष्टि करें। कपास की कली पर वायरस को अवशोषित करें, और सुई को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें। इसके बाद, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एडजस्टर स्क्रू का उपयोग करके, सुई की नोक को ब्रेग्मा पर नेविगेट करें, और फ्रेम पर तीन वर्नियर स्केल पर देखे गए स्टीरियोटैक्सिक मापों पर ध्यान दें।

ब्रेग्मा निर्देशांक से इन दूरियों को जोड़ें, या घटाएं। स्टीरियोटैक्सिक बांह पर लगे माइक्रो-ड्रिल का उपयोग करके खोपड़ी की सतह पर एक बुर छेद बनाएं। पूर्व निर्धारित डोरसोवेंट्रल समन्वय पर मस्तिष्क में सुई डालें, और वायरल तैयारी की पूर्व निर्धारित मात्रा डालें।

जलसेक के बाद, बोलस के प्रसार की अनुमति देने के लिए सुई को 10 मिनट के लिए सीटू में छोड़ दें। फिर सुई को हटा दें, और यह सुनिश्चित करने के लिए पंप चलाएं कि सुई अवरुद्ध नहीं है। वायरल इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, चूहे को इच्छामृत्यु दें, तेजी से पूरे मस्तिष्क को विच्छेदित करें, और इसे सुक्रोज काटने के समाधान में स्थानांतरित करें।

धातु चम्मच का उपयोग करके, मस्तिष्क को उठाएं, अतिरिक्त समाधान को त्याग दें, और इसे फ़िल्टर पेपर पर रखें। एक स्केलपेल का उपयोग करके, सेरिबैलम को हटा दें, और कोरोनल प्लेन में सेरेब्रम को इसकी लंबाई के साथ लगभग आधे रास्ते में काट लें। पीछे का आधा हिस्सा एलईसी ऊतक ब्लॉक है।

ऊतक ब्लॉक और शेष मस्तिष्क को सुक्रोज काटने के समाधान में वापस करें। इसके बाद, एक विब्राटोम चरण पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक बूंद रखें, और इसे एक पतली परत में फैलाएं। फिर एक चम्मच का उपयोग करके, एलईसी ऊतक ब्लॉक चुनें, और इसे गोंद पैच पर स्थानांतरित करें, जैसे कि पूर्ववर्ती कोरोनल कट का पालन किया गया है।

मंच को विब्राटोम ऊतक कक्ष में स्थापित करें, और ऊतक को जलमग्न करने के लिए जल्दी से पर्याप्त सुक्रोज काटने का समाधान डालें। ऊतक ब्लॉक की उदर सतह को ब्लेड की ओर उन्मुख करने के बाद, धीमी ब्लेड प्रगति गति का उपयोग करके उदर से पृष्ठीय तक 350-माइक्रोमीटर मोटी स्लाइस काटें। आमतौर पर, प्रति गोलार्ध सात स्लाइस प्राप्त किए जा सकते हैं।

स्लाइस को स्लाइस संग्रह कक्ष में स्थानांतरित करें। फिर कमरे के तापमान पर लौटने से पहले संग्रह कक्ष को एक घंटे के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। मस्तिष्क के शेष भाग को 48 घंटों के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें।

लक्ष्य सेल पहचान के लिए, स्लाइस को रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें, और स्लाइस एंकर का उपयोग करके इसे स्थिर करें। कम आवर्धन के तहत, अवरक्त रोशनी का उपयोग करके, एलईसी परत पांच पर नेविगेट करें। फिर उच्च आवर्धन जल विसर्जन उद्देश्य में बदलें, और पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान करें।

टेप के साथ मॉनिटर पर सेल की स्थिति चिह्नित करें। इसके बाद, एक पूरे सेल पैच क्लैंप बनाने के लिए, एक बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रो-पिपेट बनाएं, और इसे इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान से भरें। भरे हुए माइक्रो-पिपेट को इलेक्ट्रोड होल्डर में रखें और इलेक्ट्रोड होल्डर साइड पोर्ट से जुड़े माउथपीस में जोर से उड़ाकर सकारात्मक दबाव लागू करें।

माइक्रोस्कोप उद्देश्य को इस तरह उठाएं कि एक मेनिस्कस बनता है और इलेक्ट्रोड को मेनिस्कस में डालें जब तक कि इसे माइक्रोस्कोप पर नहीं देखा जा सके। सील टेस्ट विंडो खोलें, और निर्धारित करें कि पिपेट प्रतिरोध तीन से पांच मेगाहोम है या नहीं। फिर एक पिपेट टिप के साथ पहचाने गए सेल को स्पर्श करें, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली में एक इंडेंटेशन होता है।

इसके बाद, माउथपीस पर सक्शन द्वारा नकारात्मक दबाव लागू करें, जिससे पिपेट प्रतिरोध बढ़ जाए। धीरे-धीरे नकारात्मक दबाव लागू करना जारी रखें जब तक कि कोशिका झिल्ली टूट न जाए, जिसके परिणामस्वरूप पूरे सेल कैपेसिटेंस क्षणिक होते हैं। वर्तमान क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में प्रवेश करने के लिए, फ़िल्टर क्यूब्स और उचित प्रकाशिकी के साथ माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ में निर्देशित एक माउंटेड एलईडी का उपयोग करें, और 40 एक्स उद्देश्य के माध्यम से स्लाइस पर हल्की दालें लागू करें।

प्रीसिनेप्टिक रिलीज गुणों की जांच करने के लिए पांच हर्ट्ज, 10 हर्ट्ज और 20 हर्ट्ज पर कई हल्की दालों की ट्रेनें वितरित करें। बायोसाइटिन को न्यूरॉन भरने की अनुमति देने के लिए, पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन में प्रवेश करने के बाद कम से कम 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। वोल्टेज क्लैंप में, झिल्ली धारिता और इनपुट प्रतिरोध की निगरानी करें।

फिर धीरे-धीरे कोशिका के सोमा से दूर दृष्टिकोण कोण के साथ पिपेट को वापस ले लें, धारिता क्षणिकता और झिल्ली प्रवाह के धीमी गति से गायब होने का अवलोकन करें, जो कोशिका झिल्ली के पुन: सीलिंग और पिपेट सिरे पर एक बाहरी पैच के गठन का संकेत देता है। स्लाइस को 24-वेल प्लेट में पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें और रात भर इनक्यूबेट करें। ओसीटी माध्यम का उपयोग करके, क्रायोस्टैट नमूना डिस्क के लिए एक ऊतक ब्लॉक संलग्न करें।

ऊतक को फ्रीज करने के लिए, आइसोपेंटेन को एक उपयुक्त कंटेनर में रखें और नमूना डिस्क को डुबो दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊतक आइसोपेंटेन के स्तर से ऊपर है। फिर आइसोपेंटेन के कंटेनर को तरल नाइट्रोजन में कम करें, और ऊतक को जमने दें। एक बार ऊतक पूरी तरह से जम जाने के बाद, ब्लॉक के तापमान को बराबर करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए क्रायोस्टेट कक्ष में ऊतक ब्लॉक को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।

संतुलन के बाद, क्रायोस्टेट में 40-माइक्रोमीटर मोटे खंडों को काटें, और ब्लेड से अनुभागों को निर्देशित करने के लिए एक ठीक पेंटब्रश का उपयोग करें। स्लाइड को अनुभागों में स्पर्श करके इन जमे हुए वर्गों को कमरे के तापमान पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का पालन करें। प्रत्येक स्लाइड में माउंटिंग माध्यम के 150 माइक्रोलीटर जोड़ने के बाद, कवर स्लिप लागू करें, और कवर स्लिप पर धीरे से दबाकर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।

फोटोब्लीचिंग से बचाने के लिए स्लाइड्स को कवर करें, और उन्हें 12 घंटे के लिए हवा में सूखने दें। फिर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, वायरल इंजेक्शन साइट के स्थान की जांच करें। बायोसाइटिन धुंधला करने के लिए, किसी भी अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए पीबीएस में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में स्लाइस को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

फिर पीबीएस के साथ मस्तिष्क स्लाइस को धोएं जब तक कि कोई और ऑक्सीजन बुलबुले दिखाई न दें। इसके बाद, पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 1% एविडिन-बायोटिनाइलेटेड एचआरपी कॉम्प्लेक्स समाधान में तीन घंटे के लिए स्लाइस को इनक्यूबेट करें। छह पीबीएस धोने के बाद, डीएबी समाधान में प्रत्येक स्लाइस को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि न्यूरोनल संरचनाओं का बायोसाइटिन धुंधला दिखाई न दे।

ठंडे पीबीएस में स्लाइस स्थानांतरित करके प्रतिक्रिया को रोकें। फिर ब्रश का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्लाइस माउंट करें। अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के बाद, माउंटिंग माध्यम जोड़ें।

कवर स्लिप का उपयोग करके स्लाइस को कवर करें, और उन्हें हवा में सूखने दें, जैसा कि पहले दिखाया गया है। एक स्वस्थ पिरामिड सेल स्थित था और पैच किया गया था। यदि पोस्ट-सिनैप्टिक सेल पहचान की आवश्यकता होती है, तो फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करने वाले सेल को वाइडफील्ड ऑप्टिक्स का उपयोग करके स्थानीयकृत किया जाना चाहिए।

दो मिलीसेकंड की एकल प्रकाश दालों के परिणामस्वरूप सरल वेवफॉर्म ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजक पोस्ट-सिनैप्टिक क्षमता हुई। प्रकाश उत्तेजना के पांच, 10 और 20 हर्ट्ज ट्रेनों को लागू करके सिनैप्स की अल्पकालिक प्लास्टिसिटी की जांच की जाती है। दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी की जांच करते समय, 10 मिनट के लिए परिसंचारी एसीएसएफ में कोलीनर्जिक एगोनिस्ट कार्बाचोल जोड़ने से दीर्घकालिक अवसाद हुआ जो लिगैंड को हटाने के 40 मिनट बाद भी स्पष्ट था।

इंजेक्शन साइट की लंबाई की हिस्टोलॉजिकल जांच की गई थी। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एमचेरी को प्रीलिम्बिक और इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स की गहरी परतों में स्थानीयकृत किया गया था। इसके अलावा, बायोसाइटिन से भरे सेल को धुंधला करने से इसके स्थान और आकृति विज्ञान की पुष्टि हुई।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण अभिवाही मस्तिष्क क्षेत्र का सटीक पारगमन हैं, जिसे पोस्ट हॉक सत्यापित किया जा सकता है, और तीव्र स्लाइस तैयार करते समय मस्तिष्क का तेजी से विच्छेदन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को आसानी से एक व्यक्तिगत सेल प्रकार के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ जोड़ा जाता है, जैसे कि एक विशेष इंटरन्यूरॉन उप-वर्ग। ऐसा करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करेंगे जो उस विशेष सेल प्रकार में एक रिकॉम्बिनेस व्यक्त करता है।

वायरल रूप से वितरित ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं ने सिस्टम और सर्किट न्यूरोसाइंस के क्षेत्र में तेजी से प्रगति की अनुमति दी है।