Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
الكشف عن Epitopes الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) المستندة إلى اللقاحات باستخدام م المقايسة التقاط
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
هنا، نقدم بروتوكولا للكشف عن إزالة الأسطح المحايدة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضدات (VLPs). يتم إجراء التكاثر المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالجظرات المظروفة إلى جانب الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. يتم إخضاع VLPs الملتقطة في وقت لاحق إلى SDS-PAGE والتحليل الغربي لللطخة باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الأساسي الفيروسي Gag-specific.
Transcript
في مختبري، نقوم بتطوير أنظمة إنتاج لناقلات الفيروسات والجسيمات الشبيهة بالفيروسات، أو اللقاحات القائمة على VLP. يسمح فحص التقاط VLP بالكشف الحساس جدا عن المستضدات المستهدفة المعروضة على VLPs. في هذا المقايسة، نستخدم الأجسام المضادة المحايدة على نطاق واسع الموجهة ضد إزالة الأسطح المحايدة لإثبات تعرض هذه الأسطح على سطح VLP.
وهذا تقييم هام للجودة بالنسبة للمرشحين للقاح، حيث أن الملوثات المضادة للفلور التي تظهر الأسطح الحساسة للتحييد هي وحدها القادرة على الحصول على استجابة تحييدية للأجسام المضادة في اللقاحات. ابدأ بتعليق الخرز المغناطيسي إما عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ، أو الاختلاط على الدوار بمعدل 50 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق على الأقل. وفي الوقت نفسه، وإعداد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على bNABs.
استخدام 10 ميكروغرام من كل bNAB في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة ملزمة وغسل العازلة لكل رد فعل. لكل رد فعل، نقل 50 ميكرولتر من محلول حبة المغناطيسي في أنبوب رد فعل 1.5 ملليلتر، ثم وضع الأنابيب على رف الفصل المغناطيسي. انتظر حتى تجمع الخرز في الكرة أنبوب لضمان أن يتم جمع جميع الخرز، ثم إزالة supernatant.
إزالة المغناطيس وتعليق الخرز في 200 ميكرولتر من الحل bNAB المعدة مسبقا. احتضان لمدة 30 دقيقة إلى ثلاث ساعات في حين خلط على الدوار في 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، ضع أنابيب التفاعل في رف الفصل المغناطيسي، وانتظر، وأزل الناسخ الفائق.
إزالة الأنابيب من المغناطيس وغسل الخرز عن طريق إعادة تعليق في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة ملزمة وغسل العازلة. كرر الغسيل مع ربط الأجسام المضادة والغسالة العازلة، وإزالة أكبر قدر ممكن من العازلة الغسيل عند الانتهاء. إضافة العينات إلى bNABs حبة ملزمة.
إذا كانت وحدة تخزين العينة المضافة أقل من ملليلتر واحد، أضف برنامج تلفزيوني لضبط حجم العينة إلى ملليلتر واحد، ثم أعد تعليق الخرز عن طريق الأنابيب برفق. احتضان العينات والخرز لمدة 2.5 ساعة على الدوار في درجة حرارة الغرفة، وضمان أن الخرز البقاء في التعليق والحل مختلطة تماما أثناء الحضانة. ضع الأنابيب على المغناطيس وأزل الناسخة ، ثم اغسل الخرز المغناطيسي عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت.
تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من العازلة الغسيل ونقل التعليق إلى نظيفة، أنبوب رد فعل مقاوم للحرارة. ضع الأنبوب على حامل الفصل المغناطيسي وأزل الناطقة تماما. لإعداد عينات STS-PAGE المشوهة، قم بتعليق الخرز في 20 إلى 80 ميكرولتر من حاجز لايملي واحتضانه عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
تابع مباشرة مع SDS-PAGE، وضع الأنابيب على رف مغناطيسي لفصل الخرز من الحل. بدلا من ذلك، تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية. تظهر هنا نتيجة تمثيلية ل VLPs تم التقاطها لأول مرة من كريات زراعة الخلايا الخالية من الخلايا وكريات VLP باستخدام bNABs ، ثم خضعت لتحليل البقع الغربية للكشف عن البروتينات الأساسية الفيروسية.
كانت الخرز المستخدمة في فحص الالتقاط مغلفة بثلاثة bNABs مختلفة موجهة ضد إزالة الأسطح المحايدة من البروتينات الجليكوبروتين المغلف والأجسام المضادة متساوية النمط التي تعمل كعناصر تحكم سلبية. باستخدام الخرز المغلف بالأجسام المضادة النظيرية ، لم يكن من الممكن اكتشاف بروتينات Gag في عينات VLP التي تحتوي على VLPs أصلع ، أي VLPs سلبي Env ، أو VLPs عرض Env ، مما يدل على أن الربط غير المحدد ل VLPs للخرز المغلفة بالأجسام المضادة البشرية لم يتوسط التقاط VLP. كما لم تكن VLPs الأصلع ملزمة بالخرز المغلف ب bNABs ، وبالتالي ، لم يكن من الممكن اكتشاف بروتينات Gag في تحليل البقع الغربية.
في المقابل ، تم اكتشاف جميع bNABs الثلاثة التي تلتقط VLPs التي تعرض بروتينات Env - ، لذلك ، تم اكتشاف بروتينات Gag بسهولة ، مما يدل على وجود epitopes تحييد في البروتينات Env-glycoproteins المعروضة على VLPs. حاسمة لنجاح المقايسة: خلط شامل من VLPs مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة. ويتحقق ذلك على أفضل وجه باستخدام وحدات تخزين أكبر من 500 ميكرولتر تحت الدوران.
بدلا من ذلك، يمكن أن يتم إعادة VLPs الملتقطة في ظل ظروف غير الحد. وهذا يمكن من تحليل VLPs استخدام المجهر المناعي الإلكترون، أو التحقيق في المستضدات المعروضة باستخدام PAGE الأصلي.
Tags
علم المناعة والعدوى، العدد 180، التهيئة المناعية، الخرز المغناطيسي، عرض المستضد، إزالة الأسطح، الجسيمات الشبيهة بالفيروسات، الأجسام المضادةRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
