Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تطوير نماذج ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر للتصوير والتحكم البصري الوراثي لوظيفة القلب
Chapters
Summary August 25th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يصف هذا البروتوكول جيل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر التي تعبر عن eNpHR2.0 أو ReaChR opsins في القلب لتصوير OCT وسرعة القلب البصرية الوراثية. تم الإبلاغ عن تعليمات مفصلة لتصوير ذبابة الفاكهة OCT وتعديل ضربات القلب ، بما في ذلك محاكاة السكتة القلبية القابلة للاستعادة ، وبطء القلب ، وعدم انتظام دقات القلب في الحيوانات الحية في مراحل النمو المختلفة.
Transcript
يقدم البروتوكول نماذج ذبابة الفاكهة حيث يمكن تمييز وظيفة القلب والتحكم فيها باستخدام الضوء. وهذا يمكن الباحثين من دراسة أمراض القلب البشرية في ذبابة الفاكهة باستخدام الحيوانات السليمة. يمكن لهذه الطريقة أن تحقق بشكل موثوق تصوير OCT غير الغازي والتحكم البصري الوراثي في وظيفة القلب ذبابة الفاكهة.
لديها كفاءة وجودة عالية. يمكن أن تكون الوتيرة البصرية الجينية بديلا للوتيرة الكهربائية كعلاج لعلاج اضطرابات عدم انتظام ضربات القلب. يمكن توسيع نطاق التصوير OCT والوتيرة البصرية الجينية إلى أنظمة نموذجية أخرى مثل عضويات القلب وأسماك الحمار الوحشي والحلق الجنيني والقلب.
للبدء ، اجمع بين خمسة GAL4 يدوية على TM6 أنثى عذراء مزدوجة الأنابيب واثنين إلى ثلاثة ذباب ذكور من UAS Ops و Stocks لكل قارورة. في اليوم التالي ، قم بإعداد طعام شبه محدد وفقا لتعليمات مركز بلومنجتون لذبابة الفاكهة عن طريق إضافة 5.14 جرام لكل 100 ملليلتر من السكروز إلى وعاء على طبق ساخن. ثم قم بتبريده إلى 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر.
بعد ذلك ، قم بإعداد قوارير ذبابة ضيقة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الإيثانول الشبكي الشبكية بالكامل إلى 100 ملليمول إلى كل قارورة. استخدم ماصة مصلية للتخلص من خمسة ملليلترات من طعام الذبابة لكل ذبابة ضيقة. بعد الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان ، قم بتوصيل هذه القوارير ولفها في القماش الداكن لحمايتها من الضوء.
في اليوم التالي ، انقل الذباب الذي يضع البيض بثبات إلى القوارير مع الإيثانول الشبكي الذي يحتوي على طعام. حماية الرفوف مع قوارير من الضوء. بعد 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على عدد البيض الموضوعة ، تخلص من الوالدين لمنع الاكتظاظ السكاني في القارورة.
بعد ذلك ، جمع ذرية غير أنبوبي لتصوير القلب. اختر خيار UAS اليد GAL4 يرقة أو خادرة من القارورة ، وضعها على منديل ، وامسح الوسائط بلطف من سطح الجسم باستخدام فرشاة الطلاء. تحضير شريحة المجهر مع قطعة صغيرة من الشريط على الوجهين في الوسط.
بعد ذلك ، ضع اليرقة أو الخادرة برفق على سطح الشريط مع الجانب الظهري لأعلى وعموديا على الجانب الطويل من الشريحة باستخدام فرشاة أو ملاقط دقيقة. ضع ضغطا لطيفا لتوصيل اليرقة أو الخادرة بسطح الشريط. الآن ، قم بإعداد الشريحة على مرحلة التصوير مع توجيه اليرقة أو الخادرة لأسفل وتشغيل التصوير المقطعي للتماسك البصري أو مصدر ضوء OCT بواسطة برنامج التحكم بالليزر.
افتح برنامج التحكم OCT المخصص للمجال الطيفي المكتوب. ثم انقر فوق نافذة المعاينة. ثم قم بتعيين معلمات المسح الضوئي في برنامج OCT للمجال الطيفي.
استخدم المتلاعبين الدقيقين للتحكم في مرحلة العينة لجلب قلب الذبابة إلى بؤرة التركيز. اضبط الوضع البؤري لتقليل انعكاس الضوء من سطح بشرة الذبابة. أيضا ، فكر في تطبيق الزيت المعدني على سطح اليرقة أو الخادرة لتقليل الانعكاس.
بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات المسح الضوئي للحصول على صورة OCT في الوضع M والحصول على خمس مجموعات من بيانات التحكم بدون نبضات تحفيز الضوء الأحمر لحساب معدل ضربات القلب أثناء الراحة. صمم نبضة الضوء لتحفيز السرعة في برنامج التحكم OCT المخصص. لهذا ، انقر فوق علامات تبويب الإعدادات وأضف تسلسلات نبضات الضوء المصممة للتحكم في تردد النبض وعرض النبضة ومدة التحفيز ووقت الانتظار وفقا لبروتوكولات التحفيز المختلفة.
ثم افتح برنامج التحكم في الضوء لتوليد نبضات الضوء الأحمر. اختر وضع النبض في تحديد الوضع. انقر نقرا مزدوجا فوق الشكل الخاص بإعدادات ملف تعريف النبض، واختر وضع المتابع.
حافظ على شدة التوقف عند الصفر واضبط النسبة المئوية للكثافة عند حساب كثافة الطاقة الفعلية. احصل على مقاطع فيديو في وضع M لقلب ذبابة الفاكهة النابض مع التحفيز الخفيف بالنقر فوق اكتساب في برنامج OCT Control. سجل ومضات من الضوء الأحمر أسفل قلب الذبابة أثناء الحصول على التصوير.
لاحظ أن إعدادات السرعة المختلفة مطلوبة للتحكم في وظيفة قلب الذبابة باستخدام طرز ذبابة channelrhodopsin و NPHR ذات الانزياح الأحمر. افتح برنامج تجزئة قلب الذبابة المطور المخصص وانقر على ملف محدد. ثم حدد الملف المراد تحليله في واجهة المستخدم الرسومية.
أدخل كلا من الحدود الرأسية والأفقية لمنطقة القلب بالبكسل في مربعات النص العلوية. انقر على تغيير الحجم. باستخدام شريط التمرير الموجود في الأسفل ، تأكد من أن منطقة القلب بأكملها مرئية وأنها تملأ الصندوق بأكمله للمجموعة بأكملها.
بعد النقر فوق علامة التبويب "توقع" ، سيمر البرنامج عبر كل شريحة في المجموعة ويحدد منطقة القلب في حوالي ثلاث دقائق. بمجرد اكتمال التنبؤ ، انقر فوق مخطط الموارد البشرية لعرض مخطط لمنطقة القلب بمرور الوقت في نافذة جديدة. حدد مناطق الذروة أو الوادي الصحيحة ، واختر النبض ثم علامات تبويب الموارد البشرية لإنشاء شكل نهائي.
سيتم حفظ المعلمات الوظيفية في وقت واحد في ملفات CSV. تم التحقق من خصوصية الأنسجة لسائق GAL4 اليدوي عن طريق تصوير تعبير البروتين الفلوري الأخضر. يتم عرض صور OCT النموذجية للمقطع العرضي لليرقات والعذراء هنا.
لتقليد أمراض القلب المختلفة ، تم تصميم أربعة أنواع من نبضات الضوء. نبضة واحدة تستمر 10 ثوان بعد خمس ثوان من وقت الانتظار ، ولدت سكتة قلبية قابلة للترميم. بالنسبة لسرعة القلب عند ترددات أقل من معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، تم استخدام تسلسلين لنبضات الضوء بترددات سرعة تساوي نصف معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، وربع معدل ضربات القلب أثناء الراحة لمدة ثماني ثوان مع وقت انتظار مدته ست ثوان بينهما.
يتكون نمط التحفيز لزيادة معدل ضربات القلب بسبب تنشيط قناة رودوبسين ذات الانزياح الأحمر من ثلاث تسلسلات من نبضات الضوء. أدى انخفاض وتيرة تقلص القلب بعد الإشارات الضوئية إلى تباطؤ معدل ضربات القلب الذي يحاكي اليرقة والخادرة. تم تطبيق سلسلة من ثلاثة قطارات نبضات ضوئية بترددات تحفيز مختلفة على اليرقات وأظهرت قلوب الشرانق بوضوح زيادة معدل ضربات القلب بعد نبضات الضوء.
يعد اختيار إعداد النسل الصحيح ، وتركيب العينة ، وإجراء التصوير أمرا ضروريا. نأمل في نقل تكنولوجيا الوتيرة البصرية الجينية إلى نماذج حيوانية أكبر ، لدراسة أمراض قلب الثدييات واستكشاف طرق علاجية جديدة لعلاج عدم انتظام ضربات القلب.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
