Bioengineering
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开发用于心脏功能成像和光遗传学控制的 黑腹果蝇 模型
Chapters
Summary August 25th, 2022
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本方案描述了在心脏中表达eNpHR2.0或ReaChR视蛋白的黑色果蝇的产生，用于OCT成像和光遗传学心脏起搏。报告了果蝇OCT成像和心跳调节的详细说明，包括模拟不同发育阶段活体动物的可恢复性心骤停，心动过缓和心动过速。
Transcript
该协议提出了果蝇模型，其中可以使用光表征和控制心脏功能。这使研究人员能够使用完整的动物研究果蝇中的人类心脏病。该方法能够可靠地实现果蝇心脏功能的无创OCT成像和光遗传学控制。
它具有高效率和高质量。光遗传起搏可能是电起搏的替代疗法，作为治疗心律失常的疗法。OCT成像和光遗传学起搏可以扩展到其他模型系统，如心脏类器官，斑马鱼和胚胎喉咙和心脏。
首先，将 TM6 上的五只手 GAL4 和每瓶来自 UAS Ops 和库存的两到三只雄性苍蝇结合起来。第二天，根据布卢明顿果蝇库存中心的说明准备半定义的食物，将每 5.14 毫升蔗糖加入热板上的容器中。然后在不断搅拌下将其冷却至 60 摄氏度。
接下来，通过向每个小瓶中加入 50 微升 100 毫摩尔全反式视网膜乙醇溶液来制备窄飞瓶。使用血清移液管处理每只窄蝇蝇的五毫升苍蝇食物。以最大速度涡旋10秒后，将这些小瓶塞上并用深色织物包裹以保护它们免受光照。
第二天，将稳定产卵的苍蝇转移到装有全反式视网膜乙醇的食物的小瓶中。用小瓶保护架子避光。24至48小时后，根据产卵的数量，丢弃父母以防止小瓶数量过多。
接下来，收集非胖子后代进行心脏成像。从小瓶中挑选UAS选项手GAL4幼虫或蛹，将其放在纸巾上，然后用画笔轻轻擦去体表的介质。准备显微镜载玻片，中间有一小块双面胶带。
接下来，用刷子或细镊子轻轻地将幼虫或蛹放在胶带表面上，背侧朝上并垂直于载玻片的长边。轻轻按压，将幼虫或蛹附着在胶带表面。现在，将载玻片设置在成像台上，幼虫或蛹朝下，并通过激光控制软件打开光学相干断层扫描或OCT光源。
打开自定义写入的光谱域OCT控制软件。然后，单击预览窗口。然后，在光谱域OCT软件中设置扫描参数。
使用显微操纵器控制样品台，使苍蝇心脏聚焦。调整焦点位置以尽量减少苍蝇角质层表面的光反射。此外，考虑在幼虫或蛹表面涂抹矿物油，以尽量减少反射。
接下来，设置M模式OCT图像采集的扫描参数，获取5组无红光刺激脉冲的控制数据，计算静息心率。在自定义OCT控制软件中设计起搏刺激的光脉冲。为此，单击设置选项卡并添加设计的光脉冲序列，以根据不同的刺激方案控制脉冲频率、脉冲宽度、刺激持续时间和等待时间。
然后打开光控制器软件产生红光脉冲.在模式选择中选择脉冲模式。双击脉冲曲线设置图，然后选择跟随模式。
将关闭强度保持在零，并在计算实际功率密度时设置开启强度百分比。通过单击OCT控制软件中的获取，通过光刺激获取跳动的果蝇心脏的M模式视频。在成像采集过程中记录红光沿着苍蝇心脏的闪光。
请注意，使用红移通道视紫红质和NPHR苍蝇模型控制苍蝇心脏功能需要不同的起搏设置。打开定制开发的飞心分割软件，然后单击选择文件。然后在图形用户界面中选择要分析的文件。
在顶部文本框中输入心形区域的垂直和水平边界（以像素为单位）。单击调整大小。使用底部的滑块，确保整个心形区域可见，并且它填满了整个系列的整个框。
单击预测选项卡后，程序将遍历集合中的每个切片，并在大约三分钟内选择心脏区域。预测完成后，单击 HR 图以在新窗口中显示心脏区域随时间变化的图。选择正确的峰值或谷值区域，选择脉冲，然后选择心率选项卡以生成最终图形。
功能参数将同时保存在CSV文件中。通过成像绿色荧光蛋白表达验证了手部GAL4驱动程序的组织特异性。此处显示了幼虫和蛹体横截面的典型OCT图像。
为了模拟不同的心脏状况，设计了四种类型的光脉冲。在等待五秒后，单个脉冲持续 10 秒，产生可恢复的心脏骤停。对于频率低于静息心率的心脏起搏，使用了两个起搏频率等于静息心率一半的光脉冲序列，静息心率的四分之一持续八秒，中间等待时间为六秒。
由于红移通道视紫红质激活而增加心率的刺激模式由三个光脉冲序列组成。光信号后心脏收缩频率降低导致模仿幼虫和蛹的心率变慢。在幼虫身上应用一系列不同刺激频率的三个光脉冲序列，蛹心脏明显显示出光脉冲后心率加快。
正确后代的制备选择、标本的镶嵌和成像程序至关重要。我们希望将光遗传起搏技术转移到更大的动物模型中，研究哺乳动物的心脏病，并探索治疗心律失常的新治疗方法。
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