Bioengineering
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Sviluppo di modelli di Drosophila melanogaster per l'imaging e il controllo optogenetico della funzione cardiaca
Chapters
Summary August 25th, 2022
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Il presente protocollo descrive la generazione di Drosophila melanogaster che esprime le opsine eNpHR2.0 o ReaChR nel cuore per l'imaging OCT e la stimolazione cardiaca optogenetica. Sono riportate istruzioni dettagliate per l'imaging OCT di Drosophila e la modulazione del battito cardiaco, compresa la simulazione di arresto cardiaco ripristinabile, bradicardia e tachicardia in animali vivi in diversi stadi di sviluppo.
Transcript
Il protocollo presenta modelli di Drosophila in cui la funzione cardiaca può essere caratterizzata e controllata utilizzando la luce. Ciò consente ai ricercatori di studiare le malattie cardiache umane nella Drosophila utilizzando animali intatti. Questo metodo può ottenere in modo affidabile l'imaging OCT non invasivo e il controllo optogenetico della funzione cardiaca della Drosophila.
Ha alta efficienza e qualità. La stimolazione optogenetica può potenzialmente essere un'alternativa alla stimolazione elettrica come terapia per trattare i disturbi aritmici. L'imaging OCT e la stimolazione optogenetica possono essere estesi ad altri sistemi modello come organoidi cardiaci, pesci zebra e gola e cuore embrionali.
Per iniziare, combina cinque mani GAL4 su TM6 femmina vergine a doppia tubby e due o tre mosche maschi di UAS Ops e Stocks per fiala. Il giorno successivo, preparare alimenti semi definiti secondo le istruzioni del Bloomington Drosophila Stock Center aggiungendo 5,14 grammi per 100 millilitri di saccarosio in un contenitore su una piastra calda. Quindi raffreddarlo a 60 gradi Celsius con agitazione costante.
Quindi, preparare fiale di mosca strette aggiungendo 50 microlitri di soluzione di etanolo retinico all-trans da 100 millimolari a ciascuna fiala. Utilizzare una pipetta sierologica per smaltire cinque millilitri di cibo per mosca per mosca vile stretta. Dopo aver girato alla massima velocità per 10 secondi, collegare questi flaconcini e avvolgerli nel tessuto scuro per proteggerli dalla luce.
Il giorno successivo, trasferire le mosche che depongono costantemente le uova nelle fiale con etanolo retinico all-trans contenente cibo. Proteggere i rack con flaconcini dalla luce. Dopo 24-48 ore, a seconda del numero di uova deposte, scartare i genitori per evitare la sovrappopolazione della fiala.
Quindi, raccogli la progenie non tubby per l'imaging cardiaco. Scegli la larva o la pupa GAL4 della mano UAS dalla fiala, mettila su un fazzoletto e rimuovi delicatamente il supporto dalla superficie del corpo usando un pennello da pittura. Preparare il vetrino del microscopio con un piccolo pezzo di nastro biadesivo nel mezzo.
Quindi, posizionare delicatamente la larva o la pupa sulla superficie del nastro con il lato dorsale verso l'alto e perpendicolare al lato lungo del vetrino usando un pennello o una pinzetta sottile. Applicare una leggera pressione per attaccare la larva o la pupa alla superficie del nastro. Ora, impostare il vetrino sullo stadio di imaging con la larva o la pupa rivolta verso il basso e accendere la tomografia a coerenza ottica o la sorgente luminosa OCT tramite software di controllo laser.
Aprire il software di controllo dello Strumento di personalizzazione di Office del dominio spettrale scritto personalizzato. Quindi, fai clic sulla finestra di anteprima. Quindi, impostare i parametri di scansione nel software OCT del dominio spettrale.
Usa micro manipolatori per controllare la fase del campione per mettere a fuoco il cuore della mosca. Regolare la posizione focale per ridurre al minimo il riflesso della luce dalla superficie della cuticola della mosca. Inoltre, considera l'applicazione di olio minerale sulla superficie della larva o della pupa per ridurre al minimo il riflesso.
Quindi, impostare i parametri di scansione per l'acquisizione di immagini OCT in modalità M e acquisire cinque serie di dati di controllo senza impulsi di stimolazione della luce rossa per calcolare la frequenza cardiaca a riposo. Progettare l'impulso luminoso per la stimolazione della stimolazione nel software di controllo OCT personalizzato. Per questo, fai clic sulle schede delle impostazioni e aggiungi le sequenze di impulsi luminosi progettate per controllare la frequenza dell'impulso, la larghezza dell'impulso, la durata della stimolazione e il tempo di attesa in base ai diversi protocolli di stimolazione.
Quindi aprire il software del controller della luce per generare impulsi di luce rossa. Scegli la modalità impulso nella selezione della modalità. Fare doppio clic sulla figura per le impostazioni del profilo di impulso e scegliere la modalità follower.
Mantenere l'intensità off a zero e impostare la percentuale di intensità on al momento del calcolo della densità di potenza effettiva. Acquisisci video in modalità M del cuore pulsante di Drosophila con la stimolazione della luce facendo clic su Acquisisci nel software di controllo OCT. Registra lampi di luce rossa lungo il cuore della mosca durante l'acquisizione dell'imaging.
Si noti che sono necessarie diverse impostazioni di stimolazione per controllare la funzione del cuore di mosca con i modelli di canalrodopsina e NPHR spostati verso il rosso. Apri il software di segmentazione del cuore di mosca sviluppato su misura e fai clic su seleziona file. Quindi selezionare il file da analizzare nell'interfaccia utente grafica.
Immettere i limiti verticali e orizzontali della regione del cuore in pixel nelle caselle di testo superiori. Fare clic su ridimensiona. Utilizzando il cursore in basso, assicurarsi che l'intera regione del cuore sia visibile e che riempia l'intera casella per l'intera collezione.
Dopo aver fatto clic sulla scheda di previsione, il programma esaminerà ogni fetta della raccolta e selezionerà la regione del cuore in circa tre minuti. Una volta completata la previsione, fare clic sul grafico HR per visualizzare un grafico dell'area cardiaca nel tempo in una nuova finestra. Selezionare le aree di picco o di valle corrette, scegliere l'impulso e quindi le schede HR per generare una figura finale.
I parametri funzionali verranno salvati simultaneamente nei file CSV. La specificità tissutale del driver GAL4 della mano è stata verificata mediante imaging dell'espressione della proteina fluorescente verde. Le tipiche immagini OCT della sezione trasversale del corpo larvale e pupale sono mostrate qui.
Per imitare diverse condizioni cardiache, sono stati progettati quattro tipi di impulsi luminosi. Un singolo impulso della durata di 10 secondi dopo cinque secondi di attesa, generava un arresto cardiaco ripristinabile. Per la stimolazione cardiaca a frequenze inferiori alla frequenza cardiaca a riposo, sono state utilizzate due sequenze di impulsi luminosi con frequenze di stimolazione pari alla metà della frequenza cardiaca a riposo e un quarto della frequenza cardiaca a riposo della durata di otto secondi con un tempo di attesa di sei secondi intermedi.
Il modello di stimolazione per aumentare la frequenza cardiaca a causa dell'attivazione della rodopsina canalica spostata verso il rosso consisteva in tre sequenze di impulsi luminosi. La ridotta frequenza di contrazione cardiaca dopo i segnali luminosi ha provocato una frequenza cardiaca più lenta che imita larva e pupa. Una serie di tre treni di impulsi luminosi a diverse frequenze di stimolazione è stata applicata sulle larve e i cuori delle pupe hanno mostrato chiaramente un aumento della frequenza cardiaca dopo gli impulsi luminosi.
La preparazione della progenie corretta, il montaggio del campione e la procedura di imaging sono essenziali. Speriamo di trasferire la tecnologia di stimolazione optogenetica a modelli animali più grandi, di studiare le malattie cardiache dei mammiferi e di esplorare nuovi approcci terapeutici per trattare l'aritmia.
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