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このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの 96ウェル破壊を記載している。得られた懸濁液を寒天プレートに播種し、多数の個々のワームにおける細菌負荷の正確で中程度のスループット定量を可能にする。
このプロトコルは、海のエレガンスの機械的破壊を示しています。96ウェルフォーマットで、個々のワームの細菌負荷を中程度のスループットで定量化できます。この手法は、Paselベースの方法と比較して、機械的破壊の速度と均一性を向上させ、研究者が高品質のシングルワーム測定のより大きなデータセットを簡単に作成できるようにします。
このテクニックには多くの可動部品が含まれており、場所を失うのは簡単です。開始する前に、すべての材料、ラベル付きチューブ、バッファー、プレートがセットアップされていることを確認してください。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストリーダーであるミーガンテイラーです。
まず、ワームサンプルをマイクロ遠心チューブ内の1ミリリットルのM nine TX zero oneに再懸濁します。成虫を遠心分離で回収し、上清を廃棄する。同じ遠心分離パラメータを使用する。
外部細菌を最小限に抑えるために、1ミリリットルのM9TX01で2回、1ミリリットルのM9ワームバッファーで1回、ワームをすすぎます。次に、各サンプルを1ミリリットルのS培地に2倍の熱死体OP50を加えた培養チューブに再懸濁します。チューブを摂氏25度で20〜30分間インキュベートして、非広告付着細菌を腸から通過させます。
インキュベーション後、パージしたワームを1ミリリットルの冷たいM9TX01で2回すすぎ、上清を捨てます。ワームを麻痺させるために10分間チューブを氷の上に置きます。次に、無香料の漂白剤を含む1ミリリットルの氷冷Mナインワームバッファーを各チューブに追加します。
チューブを氷上で最低10分間インキュベートして、外部のバクテリアを殺します。漂白剤バッファーを廃棄し、チューブを氷に戻して、ワームがポンピングするのを防ぎます。次に、各チューブに1ミリリットルの冷たいM9TX01を加え、5秒間遠心分離します。
ミニ遠心分離機で。チューブを氷に戻し、上清を取り除きます。この手順を一度繰り返します。
ワームキューティクルの化学透過処理用。20マイクロリットルのバッファーに入ったワームを含むチューブを室温のチューブラックに移します。次に、各ウォームサンプルに100マイクロリットルのSDS / DTT溶液を追加します。
成虫のキューティクルを部分的に分解するためにベンチで最大8分間チューブをインキュベートします。この時点で、ワームは死んでチューブの底に落ち着きます。インキュベーション後、SDS/DTT上清を注意深く廃棄します。
次に、各チューブに1ミリリットルのM9TX01を追加し、短時間遠心分離してワームをペレット化します。上清を廃棄し、0.1%Triton x-100を含む1ミリリットルのM 9ワームバッファーにワームを再懸濁します。ワームの機械的破壊に備えるために、滅菌2ミリリットルの深さのウェル96ウェルプレートとシリコンプレートカバーを入手してください。
滅菌スクープスヘラを使用して、グリッドがウェルの底をかろうじて覆うように、少量の滅菌36グリッド炭化物を各ウェルに追加します。180マイクロリットルのM 9ワームバッファーを各ウェルに加えます。列と行にラベルを付けてから、シリコンプレートカバーでプレートをゆるく覆います。
次に、透過処理したワームを、M9TX01を1センチメートルの深さまで満たした小さなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡を使用して、20マイクロリットルの容量の個々のワームをピペットで取り出し、96ウェルプレートの個々のウェルに移して、ピペットに付着したワームを排出し、ペトリ皿の透明な領域から20マイクロリットルのM9TX01を吸引し、皿に戻します。すべてのワームが移されたら、96ウェルプレートを柔軟な天井フィルムのシートで覆い、紙の裏面をサンプルウェルに下に向けています。
カバーをウェルに押し下げることなく、シリコンシーリングマットをフレキシブルシーリングフィルムの上に軽く置きます。中断中の過熱を防ぐために、プレートを摂氏4度で30〜60分間置きます。プレートを冷やした後、シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し下げて密閉します。
次に、プレートを組織破壊剤に固定します。プレートを30ヘルツで1分間振とうします。次に、プレートを180度回転させ、1分間振とうを繰り返します。
プレートをベンチに2〜3回しっかりと叩いて、柔軟な天井フィルムから砂を取り除きます。プレートセットを2、400回Gで2分間遠心分離し、ウェルの底にサンプルを回収した。次に、シリコンの蓋を外し、天井フィルムを引き剥がします。
ワームダイジェストの10倍段階希釈を調製するには、96ウェルプレートの行BからDに180マイクロリットルの1X PBSを充填します。200マイクロリットルに設定されたマルチウェルピペッターを使用して、ピペッティングによってワームダイジェストをゆっくりと混合します。最大量の液体をPBSを含む96穴プレートのA列に移す。
マルチチャンネルピペットを使用して、一番上の列から20マイクロリットルを取り出し、列Bに分注し、続いて混合します。この手順を行BからC、次に行CからDに対して繰り返して、モノコロニー化ワームの細菌定量用に1000倍希釈します。プレート10〜20マイクロリットルの各希釈液を固体寒天プレート上に。
複数種のコロニー形成のために、各希釈液100マイクロリットルを10センチメートル寒天プレートにプレートする。このプロトコルを使用すると、バッファー中の外部細菌の減少に見られるように、低温麻痺ワームの表面漂白後に効果的な外部消毒が観察されました。腸関連細菌に影響を与えることなく。
ワームを手動で中断すると、異質性が高まりました。シリコーンカーバイドグリットは、Tri Andexの有無にかかわらず、破壊に理想的でした。96ウェル法では、大きなガラスビーズは96ウェル法には適していませんでした。
小さなガラスビーズは一貫した結果を生み出しましたが、先端のパイプを詰まらせました。同じ細菌のプールにコロニーを形成した線虫は、個々の細菌および複数種の細菌群集について観察された場合、腸内負荷の高い変動を示しました。GFPを発現する細菌でコロニーを形成したワームは、個々のワーム測定において不均一性を示した。
このGFP発現細菌株について、野生型ブリストルレン2匹の虫のコロニー形成を比較した。DAFに対して2つのIGF変異体は、DAF 16変異体が細菌のより大きな集団をサポートするのに対し、DAF 2はコロニー形成に対して耐性であることを示した。この異質性は特徴的であり、同じ実験の異なる実行にわたって一貫していました。
バッチダイジェストをシミュレートするためのデータの再サンプリングは、個々のワームデータと比較して分布を変更することがわかりました。ワームごとのバッチ外挿CFUは、生物学的変動の損失につながる個々のデータの算術平均を中心にしていました。生きた表面漂白剤の消化に進む代わりに、ワームをすすぎ、さらなる実験に使用することができます。
ワームが寒さから取り除かれると、動きはすぐに再開されます。
