בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

ניתן להשתמש בבדיקת תפוקה גבוהה זו כדי לצפות בהתנהגות גרביטקטית חזקה בזחלי caenorhabditis dauer. התנהגות התולעים נצפית על פני מרחקים גדולים בהשוואה למבחנים המבוצעים על צלחת פטרי. זה משפר את הרגישות של הבדיקה ומאפשר ניתוח נתונים מפורט.

חקר התנהגות גרביטקסיס יכול לספק תובנה לגבי האופן שבו תחושת הכבידה מתרחשת בקאנורהבדיטיס, שיש לה רלוונטיות להבנת מערכת שיווי המשקל של יונקים. יצירת תאי הבדיקה של גרביטקסיס, בידוד דאוארים והזרקת התולעים לתוך התאים דורשת תרגול. אתה יכול לחסוך זמן על ידי בידוד הדאוארים ויצירת התאים יום מראש.

התחילו בהתקנת מבער בונזן, סכין גילוח אחד עד שניים, צבתות, פינצטה, משטח חיתוך מפלסטיק ומכסה אדים. כדי ליצור תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מיליליטר, ועם פינצטה, להסיר את תקע כותנה מפיפטה אחת. החזיקו סכין גילוח באמצעות צבת מעל מבער הבונזן עד לקבלת תערובת חמה.

השתמש בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד. כעת, קרבו במהירות את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה והמיסו אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה עליהם, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים.

אם רווחים כלשהם גלויים לאחר ההצטרפות, נתק אותם זה מזה וחזור על שלב זה. הכינו NGM עם 4% אגר על פי נהלי התולעת הסטנדרטיים ומלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטר סרולוגי בזמן שהאגר עדיין מותך. כדי למזער את כל השינויים בעקביות של האגר עקב קירור לא אחיד, החזיקו את הפייפטר במקביל לחלק העליון של הספסל תוך כדי שרטוט האגר.

לאחר מכן לאט לאט לצייר את הפתרון ולאטום את הקצה עם parafilm לפני הסרת החדר מן pipetter. הניחו את התא שטוח כדי להתקרר ותנו לאגר להתקשות לפני התנועה. לאחר הקירור, מחממים מפתח הקסדצימלי של שלושה מילימטרים מעל מבער בונזן ויוצרים פתח פלסטיק קטן על ידי לחיצה חזקה לתוך הקיר של כל תא כחמישה מילימטרים לצד אחד של קו האמצע.

לאחר מכן, השתמש בלהב מחומם כדי להסיר את הכותנה ואת הקצוות מחודדים של התא ולאטום את הקצוות עם סרט פרפין. 10 עד 15 ימים לפני הניסוי, חתכו כל זן על שתיים עד שלוש צלחות NGM גדולות עם חיידקי OP50 ועטפו את סרט הפרפין. אסוף תולעים על ידי שטיפת המכסים והצלחות עם M9 Buffer והזרמת התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

גלולו את התולעים על ידי סיבוב ברזולוציה של 1600 x G למשך 30 עד 60 שניות בטמפרטורת החדר ושאפו את רוב מאגר M9 עם פיפטה או שואף ואקום. הוסף שבעה מיליליטר של 1% נתרן דודציל סולפט פתרון לכל כדור תולעת ולהשאיר את התולעים בו במשך 30 דקות. כדי לאפשר אוורור, המשיכו לסובב את הצינורות ברציפות במהלך תקופה זו.

לאחר מכן, הסר את חומר הניקוי על ידי שטיפתו שלוש עד חמש פעמים עם M9. לאחר הוספת חמישה מיליליטר M9, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת 60% סוכרוז מסוננת קרה. מערבבים היטב ויוצרים שיפוע הפרדה על ידי צנטריפוגה ברזולוציה של 1600 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מלא צינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מיליליטר בשני מיליליטר של M9 Buffer.

עכשיו למחוץ את הקצוות של פיפטות פסטר זכוכית כדי להרחיב את הבור. ולהשתמש פיפטות אלה כדי להעביר את השכבה העליונה של התמיסה מן שיפוע סוכרוז אל הצינורות החדשים. שטפו את הדאוארים שלוש עד חמש פעמים עם M9 Buffer.

צנטריפוגה מתנדנדת ברזולוציה של 1600 x G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושואפת את רוב תמיסת ה-M9 באמצעות פיפטה או שואב אבק. לאחר מכן, הערך את צפיפות התולעים על ידי ספירה ידנית של מספר התולעים בשלוש טיפות נפרדות של 1 מיקרוליטר תחת מיקרוסקופ מנתח, והשתמש בממוצע של ספירות אלה כדי להעריך את מספר התולעים למיקרוליטר. כעת הרחיבו את הקצה על ידי חיתוך הקצה של 10, 20 או 200 קצוות פיפטה מיקרוליטר.

הגדר את המיקרופיפטה לנפח מעט גדול יותר מנפח השאיפה המיועד. שאפו כ 1 עד 2 microliters של תמיסת תולעת מרוכזת ולאפשר כמות קטנה של אוויר להיכנס לקצה. דחפו בעדינות את קצה הפיפטה לתוך האגר תוך כדי לחיצה על המיקרו פיפטה.

פעולה זו תיצור אתר הזרקה מבלי לסתום את הקצה. שחררו את התולעים לתוך האגר והשתמשו בסרט פרפין כדי לאטום את הפתח. כדי למנוע כמה שיותר משתנים ברגע שהתאים ממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך בטמפרטורת החדר, תייג כל תא ותלה אותו אנכית בתוך כלוב פאראדיי.

בדוק בקרות אופקיות במקביל על ידי הנחת חלק מהתאים שטוחים באותם תנאים סביבתיים. לאחר מכן השתמש בתולעי N2 בעלות האוריינטציה האנכית כבקרה חיובית ובתאים בעלי אוריינטציה אופקית המכילים דאוארים N2 כבקרה שלילית נוספת כנגד זני הניסוי. לאחר מספר שעות, תולעי הדאואר מתחילות להתפזר מאתר ההתחלה ולוקח כמה שעות להגיע לשני קצות החדר.

יש להשאיר את התאים ללא הפרעה במהלך תקופה זו ולהבקיע תוך 12 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. לאחר מכן, הסר את התאים בזה אחר זה והבקיע גרביטקסיס על ידי חיפוש דאוארים חיים תחת מיקרוסקופ מנתח וסימון מיקומם בדיו. אין להבקיע תולעים בטווח של 2.5 ס”מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה, שכן תולעים אלה אינן צפויות להפגין העדפה כיוונית.

כמו כן, הימנעו מתולעי ניקוד שנראות מתות או לכודות בנוזל והשליכו תאים המכילים יותר מ-50% תולעים מתות או תולעים שוחות. כדי לכמת את התוצאות, השתמש בסמן כדי לחלק כל מחצית של התא לשבעה 3.5 ס”מ, החל 2.5 ס”מ ממקום ההזרקה. השתמש במונה ידני כדי לספור את מספר התולעים שנצפו בכל סעיף.

ב-caenorhabditis briggsae, אחוז גדול של תולעי דאואר הראה נדידה לכיוון החלק העליון של התאים. עם זאת, הבקרות האופקיות הראו התפלגות סביב מרכז התאים, מה שמעיד על התנהגות גרביטקטית שלילית. כמו כן, ההתפלגויות האנכיות של caenorhabditis briggsae ו- caenorhabditis elegans לא הראו שום הבדל המצביע על כך ש- caenorhabditis briggsae dauers מראים התנהגות גרביטקסיס שלילית הדומה לזו של caenorhabditis elegans dauers.

סוכנים משותקים כגון נתרן אזיד אינם משמשים בפרוטוקול זה. לכן, חשוב להבקיע את תאי הגרביטקסיס ברגע שהם מוסרים מכלוב פאראדיי. בדיקה זו הובילה לגילוי התנהגות גרביטקסיס שלילית ב- c.elegans.

באמצעות בדיקת מספר זנים מוטנטיים, הוא גם חשף דרישות גנטיות ועצביות לגרביטקסיס בתולעים.