Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven

Deze high throughput assay kan worden gebruikt om robuust gravitactisch gedrag te observeren bij caenorhabditis dauer larven. Wormgedrag wordt waargenomen over grote afstanden in vergelijking met testen uitgevoerd op een petrischaaltje. Dit verhoogt de gevoeligheid van de test en maakt gedetailleerde gegevensanalyse mogelijk.

Het bestuderen van gravitaxis-gedrag kan inzicht geven in hoe zwaartekrachtsensatie optreedt bij caenorhabditis, wat relevant is voor het begrijpen van het vestibulaire systeem van zoogdieren. Het maken van de gravitaxis-testkamers, het isoleren van dauers en het injecteren van de wormen in de kamers vergt oefening. U kunt tijd besparen door de dauers te isoleren en de kamers een dag van tevoren te maken.

Begin met het opzetten van een Bunsen-brander, een tot twee scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak en een zuurkast. Om een kamer te maken, verzamelt u twee serologische pipetten van 5 milliliter en verwijdert u met een pincet de katoenen plug uit één pipet. Houd een scheermesje met een tang boven de Bunsen-brander tot het heet is.

Gebruik het verwarmde mes om het taps toelopende uiteinde van de tweede pipet af te snijden, zodat de hele pipet een uniforme diameter heeft. Breng nu snel de twee gemodificeerde pipetuiteinden dicht bij de vlam en smelt ze lichtjes. Verbind deze uiteinden door ze stevig tegen elkaar te drukken, zodat de wanden van beide pipetten continu zijn.

Als er na het samenvoegen openingen zichtbaar zijn, breek ze dan uit elkaar en herhaal deze stap. Bereid NGM voor met 4% agar volgens standaard wormprocedures en vul elke kamer door deze aan een serologische pipetter te bevestigen terwijl de agar nog steeds gesmolten is. Om eventuele variaties in de consistentie van de agar als gevolg van ongelijke koeling te minimaliseren, houdt u de pipetter parallel aan het bankblad terwijl u de agar opstelt.

Trek vervolgens langzaam de oplossing en sluit de punt af met parafilm voordat u de kamer van de pipetter verwijdert. Leg de kamer plat om af te koelen en laat de agar uitharden voordat je gaat bewegen. Eenmaal afgekoeld, verwarm je een inbussleutel van drie millimeter boven een Bunsen-brander en maak je een kleine plastic opening door deze stevig in de wand van elke kamer te drukken, ongeveer vijf millimeter naar één kant van de middellijn.

Gebruik vervolgens een verwarmd mes om de katoenen en taps toelopende uiteinden van de kamer te verwijderen en de uiteinden af te dichten met paraffinefilm. 10 tot 15 dagen voor het experiment, snijd elke stam op twee tot drie grote NGM-platen met OP50-bacteriën en wikkel de paraffinefilm. Verzamel wormen door de deksels en platen te spoelen met M9 Buffer en de oplossing te pipetteren in centrifugebuizen van 15 milliliter.

Pellet de wormen door 30 tot 60 seconden op kamertemperatuur op 1600 x G te draaien en het grootste deel van de M9 Buffer op te zuigen met een pipet of vacuümaspirator. Voeg zeven milliliter 1% natriumdodecylsulfaatoplossing toe aan elke wormkorrel en laat de wormen er 30 minuten in zitten. Om beluchting mogelijk te maken, moet u de buizen gedurende deze tijd continu blijven draaien.

Verwijder vervolgens het wasmiddel door het drie tot vijf keer te spoelen met M9. Voeg na toevoeging van vijf milliliter M9 vijf milliliter koud gefilterde 60% sucrose-oplossing toe. Meng grondig en creëer een scheidingsgradiënt door gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren op 1600 x G. Vul nieuwe centrifugebuizen van 15 milliliter met twee milliliter M9 Buffer.

Verpletter nu de uiteinden van glazen Pasteur-pipetten om de boring te verbreden. En gebruik deze pipetten om de bovenste laag van de oplossing over te brengen van de sucrosegradiënt naar de nieuwe buizen. Spoel de dauers drie tot vijf keer af met M9 Buffer.

Centrifugeer dauers bij 1600 x G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-oplossing aan met een pipet of vacuümaspirator. Schat vervolgens de wormdichtheid door handmatig het aantal wormen in drie afzonderlijke druppeltjes van 1 microliter onder een ontleedmicroscoop te tellen en gebruik het gemiddelde van deze tellingen om het aantal wormen per microliter te benaderen. Verbreed nu de tipboring door het uiteinde van 10, 20 of 200-microliter pipetpunten te snijden.

Stel de micropipette in op een iets groter volume dan het beoogde aspiratievolume. Zuig ongeveer 1 tot 2 microliter van de geconcentreerde wormoplossing aan en laat een kleine hoeveelheid lucht in de punt komen. Duw de pipetpunt voorzichtig in de agar terwijl u de micropipet indrukt.

Hierdoor ontstaat een injectieplaats zonder de punt te verstoppen. Laat de wormen los in de agar en gebruik paraffinefilm om de opening af te sluiten. Om zoveel mogelijk variabelen te elimineren zodra de kamers bij kamertemperatuur in een donkere kooi van Faraday zijn geplaatst, labelt u elke kamer en hangt u deze verticaal in de kooi van Faraday.

Test horizontale controles gelijktijdig door sommige kamers plat te leggen binnen dezelfde omgevingsomstandigheden. Gebruik vervolgens de verticaal georiënteerde N2-wormen als een positieve controle en horizontaal georiënteerde kamers met N2 dauers als een extra negatieve controle tegen de experimentele stammen. Na een paar uur beginnen de dauerwormen zich van de startplaats te verspreiden en duurt het enkele uren om beide uiteinden van de kamer te bereiken.

Laat de kamers gedurende deze tijd ongestoord en scoor binnen 12 tot 24 uur na injectie. Verwijder vervolgens de kamers één voor één en scoor gravitaxis door te zoeken naar levende dauers onder een ontleedmicroscoop en hun locaties met inkt te markeren. Scoor geen wormen binnen 2,5 centimeter aan weerszijden van de injectieplaats, omdat deze wormen waarschijnlijk geen richtingsvoorkeur vertonen.

Vermijd ook het scoren van wormen die dood lijken of gevangen zitten in de vloeistof en gooi alle kamers weg die meer dan 50% dode of zwemmende wormen bevatten. Om de resultaten te kwantificeren, gebruikt u een marker om elke helft van de kamer te verdelen in zeven 3,5 centimeter, beginnend op 2,5 centimeter afstand van de injectieplaats. Gebruik een handmatige telteller om het aantal wormen te tellen dat in elke sectie is waargenomen.

Bij caenorhabditis briggsae vertoonde een groot percentage dauerwormen migratie naar de bovenkant van de kamers. De horizontale controles toonden echter verdeling rond het midden van de kamers, wat wijst op negatief zwaartekrachtsgedrag. Ook vertoonden de verticale verdelingen van caenorhabditis briggsae en caenorhabditis elegans geen verschil, wat suggereert dat caenorhabditis briggsae dauers een negatief gravitaxis-gedrag vertonen dat vergelijkbaar is met caenorhabditis elegans dauers.

Paralytische middelen zoals natriumazide worden niet gebruikt in dit protocol. Daarom is het belangrijk om de gravitaxiskamers te scoren zodra ze uit de kooi van Faraday zijn verwijderd. Deze test leidde tot de ontdekking van negatief gravitaxisgedrag bij c.elegans.

Door verschillende mutante stammen te testen, onthulde het ook genetische en neurale vereisten voor gravitaxis in wormen.