1,344 Views
•
07:25 min
•
December 09, 2022
DOI:
Этот протокол описывает две стратегии добавления липидов с комбинацией продольного и транскрипционного анализа в модельном организме C.elegans. Метод описывает, как исследовать транскрипционные изменения с использованием нескольких червей или рассеченных тканей червей и как жидкое кормление популяции насекомых может быть связано с гидротехническими методами. Лица, выполняющие эту технику, должны практиковать рассечение тканей из-за короткого промежутка времени для выполнения эксперимента для достижения адекватного транскрипционного анализа.
Для начала соберите бактерии OP50 путем центрифугирования выращенной на ночь культуры при 4000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант. Приостановить бактериальную гранулу в 20 миллилитрах бактериального разведения, диетического ограничения или основания BDR путем вихря и снова повторить центрифугирование в течение 10 минут.
После выброса супернатанта повторно суспендируйте бактериальную гранулу в среде BDR, чтобы приготовить бактериальный запас 20 X BDR. Разбавьте бактериальный запас до 5X, используя среду BDR перед использованием. Используя этанол или диметилсульфоксид в качестве растворителя, приготовьте раствор липидного сырья в новом автоклавном стеклянном флаконе и заполните стеклянный флакон аргоном или азотом для предотвращения окисления.
Перенесите раствор липидного сырья в раствор бактерий BDR для достижения желаемой конечной концентрации в условиях кормления. Тщательно перемешайте его, вихря в течение 20 секунд. Подготовьте контролируемое транспортное средство путем смешивания одинаковых объемов фильтрованного этанола или диметилсульфоксида с бактериями BDR.
Выполняйте липидные добавки и культивирование жидкости путем переноса желаемого количества липидов или контроля транспортного средства в каждую лунку из 12-луночной пластины с тремя-четырьмя репликами для каждого условия кормления. Смешайте синхронизированную суспензию червя Caenorrhabditis elegans с 5X бактериями BDR в соотношении один к одному, чтобы достичь конечной концентрации 1 500 червей на миллилитр и 2,5X для бактерий. Затем переложите два миллилитра смеси червячных бактерий в каждую лунку 12-луночной пластины.
Когда закончите, оберните 12-луночную пластину фольгой и встряхните пластину в инкубаторе с температурой 20 градусов цельсия при 100 об/мин для желаемой длины инкубации. Для липидных добавок на пластинах помените один миллилитр липидных кондиционированных бактерий в центр 10-сантиметровой среды роста нематоды или агаровой пластины NGM. Убедитесь, что окончательное рабочее решение многократно завихряется между посевом двух пластин при работе с большим количеством пластин.
Высушите пластину в темноте внутри вытяжки биобезопасности. Перенесите 3000 червей из синхронизированной червячной культуры на 10-сантиметровую пластину. Высушите пластину в вытяжке биобезопасности до тех пор, пока черви, которые плавали по пластинам, дополненным липидами, не начнут ползать.
После высыхания инкубируйте липидную кондиционированную пластину в инкубаторе с температурой 20 градусов Цельсия в течение желаемого периода времени и при использовании полиненасыщенных липидов защитите пластину от света. Подготовьте 20 микролитров окончательного раствора лизиса для каждого образца, перемешав 0,2 микролитра ДНКазы I с 19,8 микролитрами раствора лизиса в ПЦР-трубке и хорошо перемешав его путем пипетирования вверх и вниз пять раз. Чтобы извлечь РНК из небольшого количества целых червей, удалите бактерии, перенеся от 15 до 20 червей с бактериального газона на свежепосеянную пластину NGM.
Переложите от 15 до 20 червей из несеянной пластины NGM в ПЦР-трубку, содержащую 20 микролитров свежеприготовленного окончательного раствора лизиса с минимальным количеством бактерий, и инкубируйте реакцию лизиса в течение пяти минут при комнатной температуре. Как только инкубация закончится, держите образец в хорошей ванне с холодной водой и исследуйте ультразвуком червей четыре раза, пять секунд каждый раз с амплитудой 30% и пульсом в течение 15 секунд между каждым временем обработки ультразвуком. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем добавить два микролитра стоп-раствора в реакцию лизиса и перемешайте его мягким постукиванием.
Инкубируйте реакцию в течение двух минут при комнатной температуре, а затем установите трубку на лед. Чтобы извлечь РНК из ткани червя, соберите около 20 червей с бактериального газона и поместите их в свежую несеянную пластину NGM, чтобы удалить бактерии из червей. Перенесите 20 червей с как можно меньшим количеством бактерий на часовое стекло, содержащее 500 микролитров раствора М9, содержащего четыре микромолярного левамизола.
Когда черви обездвижены, рассекните зародышевую линию или кишечник с помощью иглы 25 калибра, которая может быть прикреплена к одному миллилитровому шприцу. Используя автоклавную стеклянную пипетку, перенесите рассеченные ткани в трубку ПЦР и оседайте трубку на льду в течение двух минут, позволяя откладывать материал на дне. Извлеките супернатант из трубки ПЦР перед добавлением 20 микролитров окончательного раствора лизиса и хорошо перемешайте его постукиванием.
После инкубации реакции лизиса в течение пяти минут добавьте два микролитра стоп-раствора и несколько раз постучите по трубке. Инкубируйте трубку в течение двух минут, прежде чем перейти к обратной транскрипции. В валидационном исследовании РНК, извлеченная из большой популяции и нескольких червей, показала аналогичную индукцию генов обработки нейропептидов, egl-3 и egl-21.
Это говорит о том, что экстракция РНК из нескольких червей может быть действительной альтернативой стандартным методам синтеза CDNA из больших популяций. В рассеченном кишечнике трансгенных червей lipl-4, дополненных дигомо-гамма-линоленовой кислотой, или DGLA, гены обработки нейрональных нейропептидов не были индуцированы. Добавки DGLA в различных концентрациях спасли увеличение продолжительности жизни у червей при нокдауне жира-3.
Черви с липидными добавками также могут быть обработаны для секвенирования РНК, протеомики, метаболомики и поведенческих исследований для выявления дополнительных фенотипов в этих специфических условиях. Эта методология может быть применена к исследованиям старения, липидной биологии и любой другой области исследований, целью которой является установление связи между определенным фенотипом и питательным фактором или метаболитом.
Настоящий протокол описывает методы добавления липидов в жидких и пластинчатых культурах для Caenorhabditis elegans в сочетании с продольными исследованиями и анализом транскрипции генов из объемных или нескольких червей и тканей червей.
Read Article
Cite this Article
Savini, M., Lee, Y., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).
Copy