Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
![Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase](https://cloudfront.jove.com/files/thumbs/55858_t.png)
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver
Chapters
Summary June 29th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gitterforberedelsesmetode, der gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge prøvekoncentrationen og lette billedbehandlingen.
Transcript
Peel-blot-teknikken gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske cryo-EM-prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge koncentrationen og lette billedbehandlingen. Prøvekoncentrationer kan øges inden gitterforberedelse, og skrælpletten kan justeres for at resultere i en tæt fordeling af enkeltlagsprøver til meget effektiv dataindsamling. Til at begynde med skal du stable to stykker filterpapir på 20-25 mikrometer pore størrelse og placere en lang paraffinfilm ved siden af den med papiret opad.
Placer et stykke submikronfilterpapir oven på yderligere to stykker filterpapir. Placer antikapillærtangen med det bøjede ben opad og det lige ben nedad, og vælg et gitter med 600 net med den glatte eller skinnende side opad. Placer tangen på en petriskål eller anden hævet overflade for at undgå kontakt med det rene gitter med andre genstande.
Fjern papiret fra paraffinfilmen, og træk i siderne for at skabe en lille kant. Pipetter to 150 mikroliter dråber, så 4% trehaloseopløsning er omkring en til to centimeter fra den ene korte side af paraffinfilmen. De to dråber skal være omkring en centimeter fra hinanden.
Hæld derefter flydende nitrogen i en lille polystyrenskumbeholder på en separat bænk eller på gulvet og læg en lille cryo-EM-gitterbeholder i det flydende nitrogen. Dæk polystyrenskumbeholderen med fnugfri klude. For at flyde carbonfilmen fra glimmeret skal du bruge Dumont 5 Forceps og røre den ene side af glimmeret i en lille vinkel nedad på en af dråberne af trehaloseopløsning.
Flyt glimmeret nedad for at lade vandspændingen løfte sig langsomt af kulstoffilmen. Slip glimmeret, når kulstoffilmen flyder på overfladen af dråben. Visuelt inspicere carbonfilmen for at undgå at bruge kulstof med skader i form af brud.
Indsæt gitteret, der holdes af antikapillærtangen i en 20-30 graders vinkel, i et trehalosefald i en position ved siden af, og centrer derefter gitteret under carbonfilmen. Tag kulstoffilmen op, hold gitteret i samme retning, og sænk langsomt gitteret ned på overfladen af den anden dråbe trehalose uden at bryde dråbens overfladespænding. Dette vil fjerne unødvendig kulstoffilm, der kan have viklet sig rundt om gitterets kant til den ru side.
Drej antikapillærtangen og læg dem på en petriskål med kulstofsiden af gitteret nedad. Pipetter 1,3 mikroliter af prøven i den lette trehalose menisk oven på gitteret. Derefter pipetteres opløsningen ca. 8-10 gange for at blande og fordele trehalosen og prøven på begge sider af gitteret.
Der pipetteres en eller flere 1,7 mikroliter dråber trehaloseopløsning på paraffinfilmen, mens prøve-trehaloseopløsningen inkuberes på gitteret i et minut. Drej gitteret tilbage til sin oprindelige position med kulfilmen opad, og tryk gitteret på submikronfilterpapiret ved hjælp af antikapillærtangen. Når opløsningen er absorberet af filterpapiret, og kulfilmen ligger fladt, skal du vente i tre sekunder, før du løfter gitteret og flytter det lodret på 1,7 mikroliter dråbe trehaloseopløsning.
Disse trin kan gentages mellem en til tre gentagelser eller mere, afhængigt af prøven. Blotter gitteret på de to stykker filterpapir, og løft derefter gitteret fra filterpapiret. Efter ca. 13 sekunder, afhængigt af fugtighed og prøvebuffer, dykkes gitteret ned i det flydende nitrogen i den lille styrofoambeholder og placeres i cryo-EM-gitterbeholderen eller overføres direkte til cryo-EM-screening eller dataindsamling.
En 2D-krystalprøve af human leukotrien C4-syntase udsat for skrælblot-metoden er vist her. Området til venstre for pilen blev stort set reduceret til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellem carbonfilmen og gitterbjælken, der blev skrællet og derefter skiftet. Regionen til højre for pilen blev ikke påvirket af skrælpletten.
Den nederste halvdel af billedet repræsenterer regionerne med store, for det meste enkeltlags phospho lipid dobbeltlag som følge af påføring af skrælpletten. Den øverste halvdel var ikke i en kontaktzone mellem gitterstangen og carbonfilmen og indeholdt således komplette liposomer med to phospholipid dobbeltlag. Gitterkvadratet på et 400 netgitter viser fodaftrykket af gitterbjælken og de resulterende skræl-blottede regioner samt de regioner, der ikke var i kontakt med en gitterstang eller udsat for færre skrælblot-iterationer.
Disse billeder viste blotting af et EM-gitter fremstillet ved ryginjektion på et submikronfilterpapir ved hjælp af meget tynd carbonfilm. Billederne er enkeltrammer ved første kontakt med membranen, 1.000 millisekunder efter kontakt og 2.000 millisekunder efter kontakt. Pilen angiver gitterfirkanter, hvor kapillærtrykket sprængte kulstoffilmen.
At undgå brud i carbonfilmen og kombinere submikronfilterpapir med et 1,7 mikroliter trehalosefald til sugning og derefter adskille lagene er vigtige trin. De skrællede prøver bruges til højopløsnings cryo-EM-dataindsamling efterfulgt af billedbehandling til strukturbestemmelse. Skræl-blotten giver mulighed for struktureret bestemmelse af enkeltlags protein 2D-krystaller, som tidligere var for tykke til cryo-EM.
Desuden kan den koncentrere forskellige prøver i enkeltlag på kulstoffilm.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
