Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters
Chapters
Summary June 29th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.
Transcript
De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om meerlagige en geconcentreerde biologische cryo-EM-monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de concentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken. Monsterconcentraties kunnen worden verhoogd voorafgaand aan de rastervoorbereiding en de peel-blot kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van enkellaagse monsters voor zeer efficiënte gegevensverzameling. Stapel om te beginnen twee stukken filterpapier van 20-25 micrometer porieformaat en plaats ernaast een lange paraffinefilm met het papier naar boven gericht.
Leg een stuk submicron filterpapier op twee extra stukken filterpapier. Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden en selecteer een raster van 600 mesh met de gladde of glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.
Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 microliter, dus 4% trehalose-oplossing op ongeveer één tot twee centimeter van een korte kant van de paraffinefilm. De twee druppels moeten ongeveer een centimeter uit elkaar liggen.
Giet vervolgens op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer en plaats een kleine cryo-EM-roostercontainer in de vloeibare stikstof. Bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes. Om de koolstoffilm van het mica te laten zweven, gebruikt u dumont 5 tang en raakt u één kant van het mica aan in een lichte hoek naar beneden op een van de druppels trehalose-oplossing.
Beweeg de mica naar beneden om de waterspanning langzaam van de koolstoffilm af te laten komen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft. Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.
Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang wordt vastgehouden in een hoek van 20-30 graden in een trehalosedruppel op een positie ernaast en centreer het raster vervolgens onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op, houd het rooster in dezelfde richting en laat het rooster langzaam zakken op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken. Dit verwijdert onnodige koolstoffilm die mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant is gewikkeld.
Draai de anti-capillaire tang en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht. Pipetteer 1,3 microliter van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer vervolgens de oplossing ongeveer 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.
Pipetteer een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 microliter op de paraffinefilm terwijl u de monstertrehalose-oplossing gedurende één minuut op het rooster incubeert. Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht en druk het raster op het submicronfilterpapier met behulp van de anti-capillaire tang. Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u drie seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de 1,7 microliter druppel trehalose-oplossing beweegt.
Deze stappen kunnen worden herhaald tussen één tot drie herhalingen of meer, afhankelijk van het monster. Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til vervolgens het raster van het filterpapier op. Na ongeveer 13 seconden, afhankelijk van de luchtvochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.
Een 2D-kristalmonster van humaan leukotrieen C4-synthase onderworpen aan de peel-blot-methode wordt hier getoond. Het gebied links van de pijl werd grotendeels gereduceerd tot enkellaagse 2D-kristallen in een contactgebied tussen de koolstoffilm en de rasterbalk die werd afgepeld en vervolgens verschoven. Het gebied rechts van de pijl werd niet beïnvloed door de peel-blot.
De onderste helft van de afbeelding vertegenwoordigt de regio's met grote, meestal enkellaagse fosfolipidenbilagen als gevolg van het aanbrengen van de peel-blot. De bovenste helft bevond zich niet in een contactzone tussen de rasterbalk en de koolstoffilm en bevatte dus complete liposomen met twee fosfolipide bilayers. Het rastervierkant van een raster met 400 mazen toont de voetafdruk van de rasterbalk en de resulterende peel-blotted-gebieden, evenals de regio's die niet in contact waren met een rasterbalk of werden onderworpen aan minder peel-blot-iteraties.
Deze beelden toonden de blotting van een EM-raster bereid door de teruginjectie op een submicron filterpapier met behulp van zeer dunne koolstoffilm. De beelden zijn afzonderlijke frames bij het eerste contact met het membraan, 1.000 milliseconden na contact en 2.000 milliseconden na contact. De pijl geeft rastervierkanten aan waar de capillaire druk de koolstoffilm scheurde.
Het vermijden van breuken in de koolstoffilm en het combineren van submicron filterpapier met een trehalosedruppel van 1,7 microliter om te zuigen en vervolgens de lagen te scheiden, zijn belangrijke stappen. De peel-blotted monsters worden gebruikt voor cryo-EM-gegevensverzameling met hoge resolutie, gevolgd door beeldverwerking voor de structuurbepaling. De peel-blot maakt gestructureerde bepaling mogelijk van enkellaagse eiwit 2D-kristallen die voorheen te dik waren voor cryo-EM.
Bovendien kan het verschillende monsters concentreren in enkele lagen op koolstoffilm.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
