Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver
Chapters
Summary June 29th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gridpreparasjonsmetode som gjør det mulig å skille flerlags og konsentrerte biologiske prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke prøvekonsentrasjonen og lette bildebehandlingen.
Transcript
Peel-blot-teknikken tillater separasjon av flerlags og konsentrerte biologiske cryo-EM-prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke konsentrasjonen og lette bildebehandlingen. Prøvekonsentrasjonene kan økes før klargjøring av gitteret, og peeling-flekken kan justeres for å resultere i en tett fordeling av enkeltlagsprøver for svært effektiv datainnsamling. For å begynne, stable to stykker 20-25 mikrometer porestørrelse filterpapir og legg en lang parafinfilm ved siden av den med papiret vendt opp.
Legg et stykke submikronfilterpapir på toppen av to ekstra stykker filterpapir. Plasser antikapillær tang med det bøyde benet vendt opp og det rette benet vendt ned og velg et 600 nettinggitter med den glatte eller skinnende siden opp. Plasser tangen på en petriskål eller annen hevet overflate for å unngå kontakt med det rene rutenettet med andre gjenstander.
Fjern papiret fra parafinfilmen og trekk sidene for å lage en liten kant. Pipette to 150 mikroliter dråper så 4% trehalose løsning på rundt en til to centimeter fra den ene kortsiden av parafinfilmen. De to dråpene skal være rundt en centimeter fra hverandre.
Deretter, på en separat benk eller på gulvet, hell flytende nitrogen i en liten polystyrenskumbeholder og legg en liten kryo-EM-gitterbeholder i flytende nitrogen. Dekk polystyrenskumbeholderen med lofrie kluter. For å flyte karbonfilmen fra glimmer, bruk Dumont 5 Tang og berør den ene siden av glimmeren i en liten vinkel nedover på en av dråpene trehaloseløsning.
Beveg glimmeren nedover for å la vannspenningen løfte seg sakte av karbonfilmen. Slipp glimmeren når karbonfilmen flyter på overflaten av dråpen. Inspiser karbonfilmen visuelt for å unngå å bruke karbon med skade i form av brudd.
Sett inn rutenettet som holdes av antikapillær tang i en 20-30 graders vinkel i et trehalosefall i en posisjon ved siden av, og sentrer deretter rutenettet under karbonfilmen. Plukk opp karbonfilmen, hold rutenettet i samme retning og senk rutenettet sakte ned på overflaten av den andre dråpen trehalose uten å bryte dråpens overflatespenning. Dette vil fjerne unødvendig karbonfilm som kan ha viklet seg rundt kanten av rutenettet til den grove siden.
Roter antikapillærtangene og legg dem på en petriskål med karbonsiden av rutenettet vendt nedover. Pipette 1,3 mikroliter av prøven inn i den lille trehalose menisken på toppen av rutenettet. Pipetter deretter løsningen ca. 8-10 ganger for å blande og fordele trehalosen og prøven på begge sider av rutenettet.
Pipetter en eller flere 1,7 mikroliter dråper trehaloseoppløsning på parafinfilmen mens du inkuberer prøven trehaloseoppløsning på rutenettet i ett minutt. Roter rutenettet tilbake til sin opprinnelige posisjon med karbonfilmen vendt opp og trykk rutenettet på submikronfilterpapiret ved hjelp av antikapillær tang. Når løsningen er absorbert av filterpapiret og karbonfilmen ligger flatt, vent i tre sekunder før du løfter rutenettet og beveger det vertikalt på 1,7 mikroliter dråpe trehaloseoppløsning.
Disse trinnene kan gjentas mellom en til tre gjentakelser eller mer, avhengig av prøven. Fjern rutenettet på de to stykkene filterpapir, og løft deretter rutenettet fra filterpapiret. Etter ca. 13 sekunder, avhengig av fuktighet og prøvebuffer, dypp gitteret i det flytende nitrogenet i den lille isoporbeholderen og legg det i cryo-EM-nettbeholderen eller overfør det direkte for cryo-EM-screening eller datainnsamling.
En 2D-krystallprøve av human leukotrien C4-syntase utsatt for peel-blot-metoden er vist her. Regionen til venstre for pilen ble i stor grad redusert til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellom karbonfilmen og rutenettstangen som ble skrellet og deretter forskjøvet. Området til høyre for pilen ble ikke påvirket av peeling-blot.
Den nedre halvdelen av bildet representerer regionene med store, for det meste enkeltlags fosfolipid-dobbeltlag som følge av påføring av peel-blot. Den øvre halvdelen var ikke i en kontaktsone mellom gitterstangen og karbonfilmen, og inneholdt dermed komplette liposomer med to fosfolipid-dobbeltlag. Rutenettet i et rutenett med 400 nett viser fotavtrykket til rutenettet og de resulterende skrellflekkede områdene, samt områdene som ikke var i kontakt med en rutenettstang eller utsatt for færre gjentakelser av skrellflekker.
Disse bildene viste blotting av et EM-rutenett utarbeidet av tilbakeinjeksjonen på et submikronfilterpapir ved bruk av veldig tynn karbonfilm. Bildene er enkeltrammer ved første kontakt med membranen, 1.000 millisekunder etter kontakt og 2.000 millisekunder etter kontakt. Pilen indikerer rutenettfirkanter der kapillærtrykket brøt karbonfilmen.
Å unngå brudd i karbonfilmen og kombinere submikronfilterpapir med et 1,7 mikroliter trehalosefall til sug og deretter skille lagene er viktige trinn. De skrell-blottede prøvene brukes til høyoppløselig innsamling av kryo-EM-data, etterfulgt av bildebehandling for strukturbestemmelse. Skrellflekken muliggjør strukturert bestemmelse av enkeltlags protein 2D-krystaller som tidligere var for tykke for kryo-EM.
Videre kan den konsentrere forskjellige prøver i enkeltlag på karbonfilm.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
