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JoVE Journal Bioengineering

Mechano-Node-Pore Sensing

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Journal (Bioengineering)

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Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

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Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Article DOI: 10.3791/64665-v • 05:49 min

December 2nd, 2022 •

Andre Lai*¹, Rachel Rex*², Kristen L. Cotner¹, Alan Dong³, Michael Lustig^1,3, Lydia L. Sohn^1,2

¹Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, ²Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, ³Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

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December 2nd, 2022

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Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Transcript

Wir präsentieren eine elektronikbasierte mikrofluidische Plattform zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen. Konkret messen wir einzelzellelastische und viskose Eigenschaften bei einem Durchsatz von bis zu 10 Zellen pro Sekunde. Unsere Methode erfordert eine minimale Probenvorbereitung, verwendet eine einfache elektronische Messung, ersetzt teure optische Hardware und komplexe Bildanalyse und ist zerstörungsfrei, was bedeutet, dass unser Ansatz mit nachgeschalteten Analysen kompatibel ist.

Mechano-NPS wurde auf viele Zelltypen, einschließlich Primärproben, angewendet und hat die Wirkung subzellulärer Komponenten auf die Einzelzellviskoelastizität gemessen. Es könnte verwendet werden, um das Zellverhalten zu verstehen, den Krankheitsverlauf zu bestimmen oder die Reaktion von Medikamenten zu überwachen. Um zu beginnen, entfernen Sie die plasmabehandelten Komponenten aus der Plasmakammer.

Pipeten Sie eine Zwei-zu-eins-Lösung aus Methanol und entionisiertem Wasser auf dem Glassubstrat mit vorgefertigten Elektroden. Platzieren Sie dann die PDMS-Form mit der Feature-Seite nach unten auf dem Glassubstrat. Platzieren Sie das Gerät unter dem Stereoskop, um die Ausrichtung anzupassen.

Backen Sie das ausgerichtete Gerät, um die Geräteherstellung abzuschließen. Bereiten Sie Druckquelle, Leiterplatte, Tischhardware und Datenerfassungssoftware vor. Als nächstes richten Sie die Klemmstifte mit den Löchern auf der Leiterplatte aus und richten Sie die federbelasteten Klemmstifte mit den Elektrodenkontaktpads am mikrofluidischen Gerät aus.

Führen Sie dann die Klemmstifte in die Leiterplattenlöcher ein und stellen Sie sicher, dass die federbelasteten Stifte mit den Elektrodenkontaktpads ausgerichtet bleiben. Richten Sie die elektronische Hardware ein und schließen Sie sie an. Legen Sie als Nächstes die Werte fest, um die Datenerfassungssitzung zu initialisieren, und legen Sie die Abtastrate für die Erfassung fest.

Kultur und Vorbereitung der Zellen nach dem entsprechenden Zellkulturprotokoll der Zelllinie der Wahl. Dann suspendieren Sie die Zellen in einer vorbereiteten Lösung von 2% FBS und 1X PBS in einer Konzentration zwischen 100.000 und 500.000 Zellen pro Milliliter. Halten Sie die Zellen für die Dauer der Experimente auf Eis.

Um Zellen in das mikrofluidische Gerät zu laden, schneiden Sie 30 Zentimeter Polytetrafluorethylenschläuche mit einer Rasierklinge. Verwenden Sie eine Spritze, um die Zellprobe in das Ende des Schlauchs fallen zu lassen, und verbinden Sie dasselbe Ende mit dem Geräteeinlass. Schließen Sie schließlich das gegenüberliegende Ende des Schlauchs an den mikrofluidischen Druckregler an.

Um das Experiment durchzuführen, stellen Sie den gewünschten konstanten Steuerdruck auf der Druckreglersoftware ein und lassen Sie die Probe das Gerät füllen. Wenn sich in den mikrofluidischen Kanälen Blasen bilden, verwenden Sie eine Sackgassenfüllung. Schließen Sie die Gerätesteckdose an und üben Sie einen niedrigen Druck auf den Einlass aus, um Luft durch das gasdurchlässige PDMS zu drücken.

Stellen Sie dann die gewünschte Spannung ein, indem Sie den Spannungsregler am Netzteil drehen und aktivieren Sie die Spannung durch Drücken der Einschalttaste. Schalten Sie den Stromvorverstärker ein und stellen Sie die Empfindlichkeit so niedrig wie möglich ein. Alternativ können Sie die Verstärkung so hoch wie möglich einstellen, ohne den Vorverstärker zu überlasten oder die maximale analoge Eingangsspannung des Datenerfassungsgeräts zu überschreiten.

Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Ausführen im MATLAB-Menübandmenü, um das Datenerfassungsskript NPS zu starten. m, und beginnen Sie mit der Abtastung und dem Speichern der Daten. Um das Experiment zu beenden, drücken Sie die Taste Stop in der unteren linken Ecke des Live-Plotfensters, um das Datenerfassungsskript zu beenden.

Deaktivieren Sie dann den Netzteilausgang, indem Sie die Ein-Taste drücken. Stellen Sie schließlich die Druckquelle in der Druckreglersoftware auf Nulldruck ein. Für die Datenanalyse sollte das Rohsignal ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, um das Rauschen herauszufiltern und die wesentlichen Komponenten zu extrahieren.

Entscheidend ist, dass der Stromsignalanstieg von jedem Knoten robust genug sein sollte, so dass Subimpulse leicht aus dem Differenzsignal identifiziert werden können. Maligne MCF-7-Zellen haben eine größere wCDI-Verteilung als nicht-maligne MCF-10A-Zellen, was darauf hindeutet, dass die malignen MCF-7-Zellen weicher sind als ihre nicht-malignen MCF-10A-Gegenstücke. MCF-10A- und MCF-7-Zellen, die mit Latrunculin behandelt wurden, zeigen einen Anstieg der wCDI.

Eine deutliche wCDI-Verteilung, die die beiden primären Zelltypen unterscheidet, deutet darauf hin, dass LEP-Zellen weicher sind als MEP-Zellen. Nicht-maligne MCF-10As und unbehandelte MCF-10A und MCF-7 haben einen größeren Anteil an Zellen, die sich sofort erholen, was auf eine niedrigere Viskosität hinweist als ihr malignes oder Latrunculin-behandeltes Gegenstück. Wenn die Stromanzeige ungewöhnlich erscheint, stoppen Sie das Experiment und untersuchen Sie den mikrofluidischen Kanal.

Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen und keine Verstopfungen vorhanden sind, so dass die Zellen frei vom Einlass zum Auslass fließen. Da unsere Methode die Zellen nicht schädigt, können nachgeschaltete Analysen wie RNA-seq oder Immunfluoreszenz durchgeführt werden. Dies könnte helfen, einige zugrunde liegende Gründe aufzudecken, warum Zellen unterschiedliche mechanische Phänotypen haben.

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