ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

Biology

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Summary

このプロトコルは、分析する方法を示しています

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Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).

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Abstract

市販

Protocol

あなたが始める前に

  1. すべての培養物は25℃で増殖させることが必要
  2. HL3.1解剖バッファは事前に準備されることがあります。 HL3.1の50mlのアリコートを取り、それ氷上で保管してください。
  3. HL3.1で新鮮な3.5%のホルムアルデヒド15mlを準備する。それは氷上に置きます。

幼虫の解剖

  1. 解剖のプレート上に冷たいHL3.1のドロップを置く。これは簡単に操作できるので、動物を乾燥し、スタンから動物を保持します。
  2. 長い鉗子を使用して 、放浪三齢幼虫を選択し、HL3.1のドロップに配置します。
  3. 最初に、minutienピンを把握するために短いピンセットを使用してください。後部気門の間にピンを置きます。動物は通常、自分自身を伸ばしており、口のフックの近くに幼虫の頭の中で真正面からピンを配置することが容易にピンから離れてクロールしようとします。縦動物を差し伸べる。これは、あなたがカットの間に達成することができる公開された体壁の量を最大限に高めることができます。注:最初にヘッドを固定することを選択した場合、動物がピンの周りにその身体を包んだり、それが難しいピンになっ前後にその身体を鞭打つことができる。通常は、HL3.1を除去し、再び見事な新鮮な冷たい一滴動物を置くことによってこれに対抗することができます。両手利きの科学者はまた、単に動物をつかんで、所定の位置に保持することができます。
  4. 春のはさみを使用すると、幼虫の背側後部のピンにちょうど前方水平方向の切開を行います。片足切開にハサミの刃と幼虫の吻側端に向かって背側正中線に沿って垂直に切断してください。動物の演壇で、ピンの左と右に水平方向の切開を行います。注:終了したら、結果はrostrocaudal軸に沿って幼虫の背側にある私のようになります。
  5. 臓器を削除します。幼虫にHL3.1のいくつかの追加の滴を置くことによって始めます。これは、臓器は、はるかに容易にそれらを削除できるように身体の中から浮かび上がるようになります。最初に、気管系を削除します。第二に、臓器の残りの部分をつかむためにピンセットを使用してそれらを削除。
  6. ステップ3で使用するには、体壁の左フラップと右のフラップを作った。水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸縮することを確認して時計回りの順序でフラップを固定する。

固定

25分間HL3.1の3.5%ホルムアルデヒドで各動物を修正。 5分間の二度HL3.1で動物を洗う。

ストレージ

ピンを取り外し、1X PBSを含む1.5 mlチューブに幼虫を移す。あなたがイメージを融合させた蛍光タグを使用してNMJをする予定がある場合には、2日以内に画像動物をすべき。あなたは4℃で1週間にするための解剖幼虫を保存することができます

代表的な結果

適切に解剖ショウジョウバエの幼虫にいくつかの主要コンポーネントがあります。最初に、人は特に筋肉、筋肉4,6、および7を傷つけないように特に注意を払わなければならない。これらは、勉強する最も人気のある筋肉で、それらが損傷している場合はフィレットprepを破棄し、別の動物を解剖。第二に、人は動物が最大限に各筋肉とNMJを区別することができるように引き伸ばされていることを確認する必要があります。

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Discussion

このビデオで示さ解剖手法は、実験技術の様々なショウジョウバエの幼虫を準備するために使用することができます。蛍光タンパク質タグが存在する場合、幼虫をマウントし、すぐにイメージングすることができます。そうでなければ、免疫染色は、特定のシナプスコンパートメントをマークするために行うことができます。さらに、電気生理学は簡単に神経伝達の機能を評価するために解剖幼虫で行うことができます。

ショウジョウバエのNMJは、その基本構造と機能を点灯初期の研究以来、絶大な人気を集めています。1-4 ショウジョウバエ NMJの開発の研究で確認されている分子の多くは脊椎動物で保存されている。4そのため、数多くのショウジョウバエ NMJの研究を通して学んだ洞察力は、すべての生き物におけるシナプス生物学に適用可能です。いくつかの可能なアプリケーションでは、軸索ガイダンスに関与する分子の研究、運動ニューロン疾患、学習、及びメモリなどがあります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33 Long forceps
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Short forceps
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 Used to make dissection plates
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549-25ML
Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter Fine Science Tools 26002-10
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.


Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

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References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, (2), 377-402 (2004).

Comments

2 Comments

  1. Hi. I wonder if the fixation using formaldehyde is fine for any ulterior immunohistochemistry assay. Have you any experience if there is necessities for performing the fixation with other fixative? I´m asking this regarding the preservation of cytoskeletal proteins

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 4:07 PM
  2. Very well done Mr. Brent. You have a have steady hand !    

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 17, 2009 - 10:47 AM

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