تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن هنا وصف تقنية جديدة لتحديد كمية البروتينات البروتين في المجمعات الجعوية السكيراء. في هذه الدراسة ، وقد استخدمنا أسلوب SILAC مع تنقية تقارب تليها بالترادف الطيف الكتلي لتحديد نوعية عالية مع الشركاء ملزمة للبروتين ER ، Scs2p.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chao, J. T., Foster, L. J., Loewen, C. J. Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (25), e1225, doi:10.3791/1225 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الدهون هي لبنات بناء الأغشية الخلوية التي تعمل كحواجز وتجزئة العمليات الخلوية ، ومؤخرا ، كما يشير الى جزيئات هامة بين الخلايا. لكن ، على عكس البروتينات ، والدهون هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور أن الاتجار في المقام الأول عبر طرق سيئة nonvesicular صفها ، والتي يفترض أن تحدث في مواقع الاتصال غشاء (MCSS). MCSS هي المناطق التي تكون فيها شبكية هيولي باطني (ER) يجعل الاتصال الجسدي المباشر مع العضية الشراكة ، مثل غشاء البلازما (بعد الظهر). تم تخصيب جزء من ER ER - PM - MCSS في أنزيمات الدهون التوليف ، مما يشير إلى أن يتم توجيه توليف الدهون لهذه المواقع ، ومما يدل على أن MCSS مهمة لحركة الدهون. الخميرة هو نموذج مثالي لدراسة ER - PM MCSS بسبب وفرة فيها ، مع أكثر من 1000 اتصال في كل خلية ، وطبيعتها الحفظ في جميع حقيقيات النوى. الكشف عن البروتينات التي تشكل MCSS أمر بالغ الأهمية لفهم كيف يتم إنجاز حركة الدهون في الخلايا ، وكيف يتصرفون كما يشير الجزيئات. لقد وجدنا أن ER دعا إلى توطين Scs2p ER - PM MCSS والمهم لتشكيلها. نحن نركز على الكشف عن شركاء الجزيئي للScs2p. تحديد بروتين المجمعات تعتمد تقليديا على حل اول عينات البروتين يطهر هلام إستشراد ، تليها في هلام هضم البروتين العصابات وتحليل الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة. وهذا يحد كثيرا من دراسة لمجموعة فرعية صغيرة من البروتينات. أيضا ، ويتعرض لتغيير طبيعة البروتين المجمعات أو ظروف غير الفسيولوجية أثناء العملية. للتحايل على هذه المشاكل ، ونفذنا واسعة النطاق الكمي البروتيوميات تقنية لاستخراج البيانات غير منحازة وكميا. نستخدم الوسم النظائر مستقرة مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) لدمج أنوية النظائر الأساسية في البروتينات في سلالة تحكم معلم. يتم خلط كميات متساوية من ثقافة المفتاحية ومعلم ، والثقافة SILAC المسمى معا وlysed قبل الطحن في النيتروجين السائل. نحن ثم تنفيذ إجراء تنقية تقارب لهدم المجمعات البروتين. وأخيرا ، فإننا يعجل عينة البروتين ، والذي هو على استعداد لتحليلها من قبل اللوني السائل عالي الأداء / مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. الأهم من ذلك ، وصفت البروتينات في سلالة سيطرة النظائر الثقيلة وسوف ينتج التحول الشامل / التهمة التي يمكن قياسها كميا ضد بروتينات غير المسماة في سلالة الطعم. لذا ، يمكن الملوثات ، أو غير محددة ملزمة القضاء عليها بسهولة. باستخدام هذا النهج ، حددنا البروتينات الرواية عدة لتوطين ER - PM MCSS. هنا نقدم وصفا مفصلا لنهجنا.

Protocol

مواد وطرق

  1. سلالات الخميرة
    • وتستند جميع السلالات المستخدمة في هذه الدراسة على خلفية BY4742. أدلى التزاوج arg4 سلالة الحذف (بساط أ ، his3 ، ura3 ، leu2 وarg4 : G418) : سلالة تحكم SILAC (G418 بساط أ ، his3 ، leu2 ، ura3 ، وlys2 arg4 :) لBY4742 (بساط ألفا ، تم الحصول على his3 ، leu2 ، وura3 lys2) ، والتي haploids الانتصافي تشريح الرباعيات. ولذلك ، فإن سيطرة سلالة هو عوني التغذي ليسين وأرجينين. وأدلى سلالة الطعم بواسطة تأشب مثلي PCR بوساطة باستخدام ناقلات pBS1479. لذلك ، سمة حاتمة المستخدمة في هذه الدراسة هو تنقية تقارب بالترادف (وات) علامة (3).
  2. SILAC :
    • كانت تزرع سلالة التحكم في وسائل الإعلام SILAC التسرب تستكمل مع الحد الأدنى من 98 ٪ L - يسين - 4 - D4 ،4،5،5 (0.03 غرام / لتر ، كامبريدج النظائر) و 98 ٪ L - 6 C - 13 أرجينين (0.036 غرام / L ، كامبريدج النظائر).
    • وقد نمت في المتوسط ​​سلالة الطعم الغني منتظمة مع الأحماض الأمينية النظائر الطبيعية.
  3. [ويتم تكييف هذا البروتوكول من الربيع الباردة هاربور دليل دورة المختبر (4)] المرحلة الأولى من برنامج المشورة التقنية لتنقية

    ** وفي الليلة التي سبقت هاون تنقية الخاص قبل البرد ، ومدقة -80 درجة مئوية في الفريزر. أيضا ، قبل البرد في دورق -20 درجة مئوية **

    جعل هذه المخازن الحق قبل استخدام (1 لتر للثقافة) :
    • 30 مل NP - 40 العازلة مع 25 ميكرولتر الموافقة المسبقة عن علم (1 / 2000) ، 50 ميكرولتر من DTT 1M
    • 20 مل من NP - 40 العازلة مع الموافقة المسبقة عن علم 1 / 200 ، و 50 ميكرولتر من DTT 1M
    • 10 مل من TEV - C العازلة مع 1 / 2000 الموافقة المسبقة عن علم ، و 10 ميكرولتر من DTT M 1

SILAC وإعداد

  1. تنمو 1L كل من سلالة الطعم والسيطرة على الضغط على حدة لOD ​​600 = 1،0-1،3.
  2. من أجل الثقافة في 500ml أنابيب الطرد المركزي Nalgene. تحقيق التوازن في تحميل والخلايا بيليه في غرام 2580X
  3. صب سائل الإعلام وبيليه resuspend مع 50ml من البرد O 2 درهم في حين نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي 50ml. خلايا بيليه. ** يمكنك تجميد بيليه في -80 درجة مئوية **
  4. ** ** مباراة هامة للثقافة سلالة السيطرة على الطعم ثقافة السلالة في 1:01 من الوزن الجاف بيليه.
  5. بيليه Resuspend كل خلية في 10ML من NP - 40 العازلة مع 1 / / 2000 البروتياز كوكتيل المانع (PIC).
  6. مزج الثقافات الخلية اثنين من الصب مباشرة أنبوب واحد على الآخر.

    طحن

  7. صب السائل N 2 في هاون قبل المبردة والسماح له لتتبخر تماما. إضافة 2 مل من الخلايا إلى هاون في حركة دائرية. صب بعض N 2 السائل لتجميد الخلايا. طحن الخلايا حتى تصبح الخلايا مسحوق ناعم. كرر العملية حتى يتم إيقاف جميع الخلايا. ** لا تسمح للخلايا لذوبان الجليد. إضافة السائل N 2 عند الضرورة **
  8. نقل المسحوق إلى كوب من الجليد الباردة وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. عندما تبدأ حواف أذاب ، إضافة 20 مل من NP 40 العازلة مع 1 / 200 الموافقة المسبقة عن علم.
  9. نقل النفط الخام الى lysate أنابيب Nalgene 40 مل. تدور 39000 xgfor 30 دقيقة.
  10. أثناء انتظار ، واتخاذ 300 ميكرولتر من الخرز 2B Sepharose (GE). تغسل حبات في 300 ميكرولتر من NP - 40 العازلة (1 / 2 ، 000 PIC) 3 مرات. Resuspend الخرز في 300 ميكرولتر العازلة بحيث تكون في الطين 1:1.

    قبل إزالة الخلايا lysate

  11. طاف لنقل أنبوب جديد وإضافة الخرز 2B Sepharose. احتضان على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة.
  12. أثناء انتظار ، واتخاذ 300 ميكرولتر من الخرز مفتش 6 Sepharose (GE). تغسل حبات في 300 ميكرولتر من NP - 40 العازلة (1 / 2 ، 000 PIC) 3 مرات. Resuspend الخرز في 300 العازلة _l بحيث تكون في الطين 1:1.
  13. بيليه الخرز. طاف لنقل أنبوب جديد. ** حفظ قسامة من lysate الخلية لاحقا الغربية التنشيف **

    ملزمة لحبات sepharose مفتش

  14. إزالة الخرز 2B Sepharose بواسطة الطرد المركزي. إضافة حبات مفتش (المعدة مسبقا في الطين 01:01). فصل المحتويات إلى قسمين أنابيب للربط أكثر كفاءة. احتضان على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة 2 ساعة.
  15. تدور باستمرار الخرز. ** حفظ قسامة من فصيل غير منضم **
  16. تغسل حبات ب 10 العازلة NP - 40 مل (1 / 2 ، 000 PIC).
  17. تغسل حبات مع 3 العازلة TEV - C مل (1 / 2 ، 000 PIC). ** حفظ قسامة من الخرز. وهذا يعكس كفاءة ** ملزم

    يبلغ حجمه من الخرز التي تشطر مفتش البروتيني TEV

  18. إضافة 5 ميكرولتر من AcTEV إلى 1ml من TEV - C العازلة (مع 1 / 2 الموافقة المسبقة عن علم ، 000). بعد خلط ، منفصلة محتويات قسمين أنابيب 1.5 مل إيبندورف لمزيد من خلط كفاءة. احتضان على منصة دوارة في الغرفة الباردة بين عشية وضحاها.
  19. تدور باستمرار الخرز ونقل إلى شطافة أنبوب 1.5 مل الطازجة. تغسل حبات مع 0.5 مل إضافية TEV - C العازلة
  20. الجمع بين elaute في أنبوب واحد. يجب أن يكون 1.5 مل من شطافة في المجموع.** حفظ قسامة من شطافة TEV **

    حمض التريكلوروسيتيك حمض (TCA) precipatation (لتحليل الطيف الكتلي على أساس ، ونحن نوصي باستخدام EtOH / هطول الأمطار خلات)

  21. ضبط aliquots إلى 25 ٪ مع 100 ٪ TCA TCA. للقيام بذلك ، فصل شطافة 1.5 إلى 2 مل أنابيب ميكرولتر من 750 لكل منهما. إضافة 250 ميكرولتر من 100 ٪ TCA إلى الأنبوب. وينبغي حل دورك حليبي.
  22. مكان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع vortexing الدورية.
  23. تدور في أقصى سرعة أجهزة الطرد المركزي في الجدول العليا في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة.
  24. يغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة التي تحتوي على الأسيتون 0.05 N حمض الهيدروكلوريك وتدور لمدة 5 دقائق على السرعة القصوى (الغرفة الباردة).
  25. يغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الأسيتون وتدور لمدة 5 دقائق على أقصى (الغرفة الباردة).
  26. إزالة بعناية والأسيتون بيليه الجافة.
  27. لتلطيخ الفضة ، وresuspend بيليه في 50 ميكرولتر من العازلة 1X عينة SDS.

    EtOH precipatation / خلات

  28. إضافة 20 ميكروغرام من الجليكوجين
  29. تخفيف عينات 5X مع EtOH 100 ٪ وتعديل إلى 50 مم 3 COO ناتش مع المخزون 2.5 م ، ودرجة الحموضة 5.0
  30. موقف حل ل2hr
  31. عجلت بيليه البروتين بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في العاشر ز 12000 في درجة حرارة الغرفة.

NP - 40 العازلة (200 مل)

الأسهم تركيز إضافة
10 فوسفات الصوديوم العازلة ملم (7.2 درجة الحموضة) 0.1 M 20 مل
150 مم كلوريد الصوديوم 2 م 15 مل
1 ٪ NP - 40 100 ٪ 2 مل
50 ملي ناف 1 م 10 مل
0.1 ملم نا 3 4 VO 10 ملي 2 مل
حجم 200 مل

ADD قبل الاستخدام :

  1. 1 / 1 ، 000 من DTT M 1
  2. 1 / 2 ، 000 من الموافقة المسبقة عن علم (مثبطات البروتياز كوكتيل)

TEV - C العازلة (50 مل)

الأسهم تركيز إضافة
25 ملم تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0) 100 ملي 12.5 مل
150 مم كلوريد الصوديوم 2 م 3.75 مل
0.1 ٪ NP - 40 100 ٪ 50 _l
0.5 مم EDTA 500 ملم 50 __l
حجم 50 مل

ADD قبل الاستخدام :

  1. 1 / 1 ، 000 من DTT 1M
  2. 1 / 2 ، 000 من الموافقة المسبقة عن علم

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ينبغي أن aliquots حفظ أثناء إجراء تنقية ما يلي : (1) lysate الخلية قبل تطهيرها ، (2) جزء محدد ، (3) جزء غير منضم ، و (4) جزء eluted. نوصي تحليل محتويات البروتين من aliquots أعلاه الغربية النشاف استخدام الألغام المضادة TAP الضد أو تلطيخ الفضة لتعكس كفاءة ملزمة ويبلغ حجمه من التجربة. وترد أمثلة من الجل الملون a الفضة وصمة عار في الشكل 1.

منذ SILAC يوفر لنا مع القياسات غير منحازة وكميا من الشركاء بروتين ملزمة ، ونحن نفعل سوى المرحلة الأولى من عملية تنقية المشورة التقنية لتقليل الخسائر العينة. إذا واجهت كميات كبيرة من الملزم غير محددة ، قد ترغب في تنفيذ بروتوكول بأكملها ، والتي يمكن العثور عليها في دليل الباردة سبرنغ هاربور (4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
  2. Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
  3. Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
  4. Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics