בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

בנקאות המוח דגימה שיטתית של חומר ביולוגי מספק את הבסיס stereology משוחדת למקסימום את פוטנציאל נתונים המתקבלים הדגימה כל אחד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stereology משוחדת היא שיטה מדויקת ויעילה לאמוד את מספר נוירון הכולל (או סוג תא אחר) באזור מסוים של עניין

Protocol

חלק 1: טרום עיבוד של רקמות

  1. רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר).
  2. המוח צריך להיות חסום stereotaxically, להסיר הגולגולת, שקל, ונפח נחוש 2. רקמה אמור להיות cryoprotected בפתרונות סוכרוז מדורגים עם ריכוז סופי של סוכרוז 30% חיץ פוספט. גושי רקמה אמור להיות קפוא isopentane ב -65 ° C ו המאוחסן ב -80 ° C עד שאתה מוכן לחתוך.

חלק 2: דגימה שיטתית

  1. דגימה שיטתית מסתמך על תוכנית ראויה לפני חתך. האזור כולו של עניין הן את גודל מקורי, הזנב ואת הגב, הגחון צריך להיות מוגדר היטב. אטלס stereotaxic של המין בשימוש עוזר להגדיר את האזור של הריבית כדי לקבוע את אורך האזור של עניין. לאחר אורך האזור של עניין נקבע יש צורך להקים את מרווח הדגימה. לדוגמה, מאטלס stereotaxic לך לקבוע כי היקף כולו rostro-הזנב של האזור של עניין הוא כ 3 מ"מ אורך, כאשר חתך במישור העטרה. לאחר מכן אתה מחליט להגדיר את cryostat סעיף ב 50μm, בקצב הזה יהיה לך 60 סעיפים המכסים את היקף מקורי, הזנב של האזור של עניין. לצורך המחקר טיפוסי stereological משוחדת 6-10 חלקים שנדגמו באופן שיטתי נדרשים לקבל תוצאות אמינות. בדוגמה זו 10 סעיפים ברווחים שווים לאורך כל תוצאה rostro-הזנב היקף במרווח דגימה של 1 / 6 חלקים.

חלק 3: יצירה של הבנק המוח

  1. לאחר תדר הדגימה סעיף נקבע, הצעד הבא הוא לקבוע איזה כתמים יבוצע מיד. לדוגמה, אם אתה מכתים עם סגול cresyl תוכלו לתפוס 1 / 6 חלקים בשקופית. זו תהיה סדרה 1. אם אתה יודע אולי יש נוגדנים פוטנציאל כמה שאתה רוצה לרוץ, אבל גם רוצה לראות את הנתונים מספק כתם הראשי שלך או פשוט אין לך את הזמן כדי לבצע את אימונוהיסטוכימיה, במקום סדרה הנותרים 5 סעיפים כדי שהם היו פרוסים לשמר אנטיגן בארות המכיל (1 פוליוויניל% pyrrolidone, אתילן גליקול 50% o.1M PBS, Ph 7.4). הטבלה שלהלן מספקת תוכנית דגימה המורכב שקופית 1 ו 1 צלחת (צלחת 48-היטב רגיל) סעיפים כחלק הבנק מוח (טבלה 1).
    טבלה 1
    טבלה 1. הדגימה סעיף תדר כאן הוא 1 / 6. בסעיף הראשון מושם על שקופית עבור מכתים סגול cresyl ולמחרת 5 סעיפים ממוקמות לתוך אנטיגן לשמר. מספר סעיף 7 הוא נתפס אז בשקופית וחתכים 9-12 ממוקמים אנטיגן לשמר. מחזור זה חוזר על עצמו עד לאזור של עניין או בלוק של רקמות מחולק ממצה.
  2. השלב הבא הוא סעיף ממצה את גוש של רקמה. מניחים כמות קטנה של הטבעה בינוני על צ'אק ולתת לו להקפיא. מניחים את צ'אק לתוך הראש microtome ו לגלח מספיק של המדיום קפוא יש משטח שטוח. הסר את צ'אק מהראש microtome מקום שטוח בתוך cryostat. יוצקים הטבעה בינוני על צ'אק ועל בתוקף במקום לחסום את המוח עם הצד החתוך stereotaxically ממוצבת ביובש על צ'אק. לאט לחלוטין להטביע את המוח הרכבה בינונית. מניחים את צ'אק עם המוח לתוך הראש microtome וסעיף באמצעות פרמטרים שנקבעו מראש עבור תדר הדגימה סעיף.
  3. לאחר בלוק של רקמות כבר מחולק ממצה וחתכים ממוקמות לתוך בארות, מכסים את הצלחת עם מכסה, עוטפים את המכסה עם parafilm, ומכניסים למקפיא -20 מעלות צלזיוס. התחבר המספר הכולל של החלקים שצולמו עבור כל סדרה, רווח בסעיף הדגימה, ומספר הסדרה עבור כל חיה. יומן זה יהיה חיוני כדי לעקוב אחר הסרת הבאות של חלקים מהבנק המוח אימונוהיסטוכימיה בעתיד.

חלק 4: תוצאות נציג:

דגימה שיטתית באופן זה כבר מקובל במעבדה שלנו במשך 3 השנים האחרונות. היו לנו הרבה הצלחה בביצוע אימונוהיסטוכימיה על החומר אוחסן ב אנטיגן לשמר שלוש שנים אחרי זה היה פרוס ללא הידרדרות של האות (איור 1). יתר על כן, כחלק הבנק המוח שלנו יש לנו מחובר קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית של הלא אנושיהמוח הפרימטים (איור 2) במסגרת תוכניות לטווח ארוך המחקר שלנו.

באיור 1. זהו קטע מן המוט העורפית של פרימטים לא אנושיים immunostained עבור NeuN מראה הן שכבה VI ו ביניים נוירונים החומר הלבן. סעיף זה בפרט אוחסן אנטיגן לשמור על -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 2 שנים. בר סולם = 100μm.

figure2
איור 2. Vervet הבנק המוח שלנו מורכב כיום קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית מ 30 קופים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דגימה שיטתית היא שיטה זולה שנועדה למקסם את חומר מחקרי. אסטרטגיה זו הדגימה נועדה לציית לכללי stereology משוחדת הדורש דגימה שיטתי ברחבי האזור. זה קריטי, כי את סדר הסעיפים עבור כל סידרת נשמר. במעבדה שלנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו עבור הבנקאות הן אוגר והלא אנושי חלקים במוח הפרימטים. עד כה אספנו חלקים במוח קרוב ל 20,000 קוף vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) ובאופן שגרתי לבצע immunohistochemisty על סעיפים שאוחסנו במשך למעלה משנה. היתרונות של הבנק היטב המאופיינת במוח כוללים את האפשרות לאסוף נתונים בין החלטות מימון, היכולת לסטודנטים חדשים במהירות כדי לאסוף נתונים, לצמצם את השימוש וטיפול בבעלי חיים חדשים ובכך למקסם קרנות מחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito לקבלת תמיכה טכנית המשיכה שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylene glycol Fisher Scientific E178-4
Polyvinyl pyrrolidone Fisher Scientific BP431-500
Thermal Scientific Embedding Medium Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
  2. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics