Multi-купе ЦНС Нейрон-глии сотрудничеству культуры микрожидкостных платформы

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Мы разработали новый несколькими отделениями нейрона со-культуры микросистемы платформу для экстракорпорального ЦНС Аксон-глии взаимодействия исследования. Платформа способна проводить до шести независимых экспериментов параллельно и изготовлены с использованием недавно разработанных макро / микро гибридный метод изготовления.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (31), e1399, doi:10.3791/1399 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Часть 1: Подготовка мастер формы с несколькими отделениями нейрона со-культура изготовления устройства

  1. Первый шаг для изготовления ПММА мастера, чтобы сделать 3,5 мм в глубину отсеков. Одно отделение сомы и шесть аксон / глии отсеков определяются на блоке ПММА использованием микро-фрезерный станок (MDX-40, Roland или любой другой фрезерный станок с ЧПУ). ПММА мастер затем обрабатывали ультразвуком в изопропилового спирта в течение 10 минут, чтобы удалить мусор.
  2. Массивы 2,5 мкм высоких структур гряды по образцу 50,8 мм х 50,8 мм стекло от стандартного процесса фотолитографии с последующим травлением мокрого стекла.
    Во-первых, массив хребта структуры по образцу очищены стеклянную подложку с положительными фоторезиста S1818 использованием фотолитографии. S1818 является спин-покрытие на подложке (4000 оборотов в минуту), мягкие основан при 110 ° С в течение 5 мин, а затем под воздействием УФ света (84 мДж / см 2) с помощью маски Aligner последующим развитием фоторезиста в MF319 в течение 40 секунд. Затем стекло фоторезиста узорной подложкой погружается в буфер оксида травления (BOE) при комнатной температуре в течение 6-7 минуты, чтобы получить 2,5 мкм высоких структур хребта. Наконец, слой фоторезиста удаляют ацетон, изопропиловый спирт, после тщательного промывания в деионизованной (DI) воде.
  3. Стеклянную подложку с микро-гребень структур горячего тиснения с мастером ПММА передавать свои узоры.
    Во-первых, ПММА мастер формы и стеклянные подложки вручную выравнивается и помещен на горячую прессы. Затем, при повышении температуры до 115 ° C. Как только желаемая температура будет достигнута, 0,5 тонны веса применяется в течение 5 минут. Через 5 минут, температура охлаждается до 40 ° С и давление не будет отпущена. Мастер ПММА затем разрезается на 50,8 мм х 50,8 мм размер блока.
  4. PDMS предварительно полимера (Sylgard 184) смешивается с отвердителем в соотношении 10: 1 по массе.
  5. ПММА мастер находится внутри бочки и PDMS смесь выливают на вершине ПММА мастер для изготовления мастер PDMS. Он помещается в эксикатор связано с вакуумным насосом. PDMS вылил на вершине ПММА мастер затем дегазируют в течение 15 мин для удаления пузырьков, образующихся при PDMS процесса перемешивания.
  6. Когда все пузырьки удаляются, PDMS помещают в печь выровняли 85 ° C в течение одного часа для полимеризации.
  7. После PDMS полностью вылечить, PDMS мастера снимают из ПММА мастера и помещен эксикаторе с 2-3 каплями трихлорсилана и пылесосом в течение 15 минут, чтобы пар покрыть поверхность PDMS мастера. Трихлорсилана покрытие облегчает выпуск окончательного PDMS нейрона со-культуры устройств от мастера PDMS. После нанесения покрытия, PDMS мастер кратко промыть изопропиловый спирт для удаления чрезмерного трихлорсилана и сушат с N 2 газа.

Часть 2: Нейрон культуры устройства репликации

  1. PDMS предварительно полимера (Sylgard 184) смешивается с отвердителем в соотношении 10: 1 по массе.
  2. PDMS смесь выливают на вершине PDMS мастера и дегазированной в эксикаторе связаны с вакуумным насосом в течение 15 минут. Важно не влить слишком много PDMS, так что 3,5 мм структуру PDMS на мастер не полностью погружены в воду.
  3. Когда все пузырьки удаляются, PDMS помещают в печь выровняли 85 ° C в течение одного часа для полимеризации.
  4. PDMS вынимается из печи после одного часа и оставляют при комнатной температуре, чтобы остыть. Затем, PDMS устройств нейрона культуры осторожно снимают с мастером PDMS. Очищенные от PDMS устройства обматывают парафильмом чтобы защитить их от пыли и мусора.
  5. PDMS устройств, завернутый с парафильмом, разрезать на отдельные части, используя сверлильный станок оснащен лезвием.

Часть 3: Устройство сборки

  1. PDMS нейрона культуры устройство помещается внутри плазмы чистым и подвергаться воздушной плазмы в течение 90 секунд, чтобы сделать поверхность устройства PDMS гидрофильными. Это лечение плазмы будет способствовать микроканалов быть заполнен питательной среды после сборки поли-D-лизин покрытием подложки.
  2. Устройства получавших плазмы затем погружали в 70% этаноле в течение 30 минут для стерилизации и переехал в стерилизованной био-капюшон.
  3. Стерилизованное устройства вывезены из 70% этанола и сушат Millipore фильтруется N 2 газа. Сушеные устройства размещены в верхней части поли-D-лизин покрытием полистирола 6-луночный планшет культуры и мягкое давление применяется для обеспечения уплотнения между подложкой и устройства.
  4. Культура СМИ и заполнения в отсек сомы, а затем, заполнив шесть аксон / глии отсеков. Лучше дать 1-2 минут паузы перед заполнением аксон / глии отсеков после добавления питательных сред в купе сомы обеспечить, чтобы ни пузырьков внутри микроканалов.
  5. Устройства заполнены питательных сред, инкубируют в 37 ° С инкубатор ночь полоскать любые возможные мусора или токсичных остатков.

Часть 4: Загрузка клеток и нейронов-олигодендроцитов совместно культуры

  1. В первый день из культуры клеток, первичных нейронов переднего мозга клетки из эмбриональных день 16-18 крыс загружается в отсек сомы в плотности записи в 500 клеток / мм 2. Во-первых, питательные среды внутри и отсек сомы и аксонов / глии отсеки атмосферный использованием пипетки до ячейку нагрузкой. Затем, 38500 клеток, разводят в 40 мкл культуральной среды, загружаются в соме отсеке вокруг микроканальных заливов. Важно не касаться устройства PDMS при загрузке клеток, так как она может нарушить уплотнение между устройством и подложки.
  2. Инкубируйте ячейка загружается устройства в течение 30 минут в 37 ° С инкубатор для повышения адгезии клеток к субстрату. После инкубации все отсеки заполняются питательных сред.
  3. Клетки культивировали при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 инкубатора и только половина из питательных сред меняется каждые 3-4 дня.
  4. После 14 дней нейрона культуры в пробирке, олигодендроциты добавляются к аксону / глии отсеков для совместного культуры. Олигодендроцитов, рассеченные из полушарий Sprague-Dawley крыс в постнатальный день 1-2, добавляются каждый аксон / глии отсеке области плотностью 1000 клеток / мм 2. Перед загрузкой клеток, примерно 60% медиа-культуры внутри отсеков атмосферный с пипеткой. Предупреждение должно быть сделано не касаться нижней подложки, так как это может повредить аксонального сети формируется на подложке. Затем, 6700 олигодендроцитов клеток, разведенного в 5 мкл культуральной среды, будут добавлены в аксон / глии отсеков. Клетки инкубировали в течение 1 часа и отсеки заполняются питательных сред.
  5. Клетки культивировали при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 инкубатора и только половина из питательных сред меняется каждые 3-4 дня в течение еще ​​двух недель.

Часть 5: Представитель Результаты:

Когда эксперименты проводились должным образом, нейронные клетки загружены в купе сомы найти близкие к микроканальных заливов и аксонального слоя начинают формироваться внутри аксона / глии отсеков через 1 неделю культуры. Знак нейрона агрегации клеток внутри отсека сома может быть признаком того, что клетки не здоровы. При загрузке олигодендроциты после двух недель культуры нейронов, аксонов / глии отделения должны быть покрыты плотным слоем аксонов и олигодендроциты должны быть загружены на вершине аксонального слоя.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема иллюстрации высокой пропускной микрожидкостных несколькими отделениями ЦНС нейронные совместно культуры платформы. Поперечное сечение показывает изоляцию аксоны нейронов из сомы и дендритов, а также жидкостных изоляцию между отсеками с минуту жидкостный уровень разницы. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изготовление и монтаж шаги для нескольких отсеков PDMS микрожидкостных совместно культуры устройства. Каждое устройство помещается в одну лунку обычные 6-и полистирола пластины культуре клеток. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали с несколькими отделениями совместно культуры платформу для изучения млекопитающих ЦНС Аксон-глии взаимодействия. ЦНС аксонов были успешно изолированы от нервных клеток органов / дендритов и олигодендроцитов были успешно со-культурный внутри устройства. Нейрон плотности можно варьировать, приложений, но слишком низкой или слишком высокой концентрации может вызвать отмирание клеток. Кроме того, важно изменить только половина медиа-культуры так, чтобы клетки или аксонального слой на подложке, не повреждены. Мы ожидаем, что эта система станет мощным инструментом для изучения ЦНС Аксон-глии сигнальных сетей в пробирке и указать путь к высокой пропускной способности платформы для скрининга факторов роста или потенциальных кандидатов в лекарства, которые способствуют миелинизации и миелина ремонта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья / Национальный институт психического здоровья (NIH / NiMH) грант № 1R21MH085267.

References

  1. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
  2. Xia, Y., Whitesides, G. Soft Lithography. Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).
  3. Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
  4. Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics