Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Biology

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Summary

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

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Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (31), e1399, doi:10.3791/1399 (2009).

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Abstract

Presentamos una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma microsistema en el sistema nervioso central la investigación in vitro de interacción axón-glia, capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo de alto rendimiento. Hemos desarrollado un método de fabricación para crear nuevos dispositivos de microfluidos que tienen estructuras de escala micro y macro en el mismo dispositivo a través de un simple proceso de litografía suave, que permite la fabricación en masa con una buena repetibilidad.

El compartimiento multi-co-cultivo de microfluidos plataforma se compone de un compartimento de soma de las neuronas y seis compartimentos axón / glía de los oligodendrocitos (MCO). El compartimiento del soma y axón / glía compartimentos están conectados por las matrices de los axones de guía de microcanales que funcionan como barreras físicas para limitar soma neuronal en el compartimiento del soma, al tiempo que permite que los axones crezcan en axón / compartimentos glia. LB carga en compartimentos axón / glía sólo puede interactuar con los axones, pero no con el soma neuronal o dendritas, lo que permite localizadas las células de axón estudios de interacción. Los microcanales también permitió el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permitiendo seis experimentos independientes que se realizará en un solo dispositivo de alto rendimiento.

Soft-litografía con poli (dimetilsiloxano) (PDMS) es una técnica muy utilizada en microdispositivos biomédicos. Depósitos en estos dispositivos se define comúnmente por la perforación manual. Aunque la alineación simple, pobre y la naturaleza de tiempo del proceso hace que este proceso no es adecuado cuando un gran número de embalses que se creó en repetidas ocasiones. El nuevo método no requiere la perforación manual de reservorios, la superación de tales limitaciones. En primer lugar, siete depósitos de agua (profundidad: 3.5 mm) se realizaron sobre un poli (metacrilato de metilo) (PMMA) bloque con una máquina de fresado micro. Entonces, las matrices de las microestructuras cresta, fabricado en un sustrato de vidrio, se caliente en relieve contra el bloque de PMMA para definir microcanales que conectan el soma y el axón / glía compartimentos. Este proceso dio lugar a macro-escala de depósitos (3,5 mm) y la micro-escala de los canales (2,5 m) para coincidir con un solo maestro PMMA. Una réplica de PDMS que sirvió como maestro de molde se obtuvo utilizando la litografía blanda, y el último dispositivo de PDMS se ha replicado de este maestro.

Neuronas primarias de E16-18 ratas fueron cargados en el compartimento soma y cultivadas durante dos semanas. Después de una semana de cultivo celular, los axones se cruzó microcanales y formó la capa de red axonal sólo dentro de los compartimentos axón / glía. Axones crecieron de manera uniforme a lo largo de seis axón / glía compartimentos y LB de P1-2 ratas se han añadido a los compartimentos axón / glía a los 14 días in vitro para el co-cultivo.

Protocol

Parte 1: Preparar un molde maestro para varios compartimientos de neuronas co-cultivo fabricación de dispositivos

  1. El primer paso para fabricar el maestro de PMMA es hacer compartimentos 3,5 mm de profundidad. Un compartimiento soma y seis compartimentos axón / glía se definen en un bloque de PMMA utilizando una máquina de fresado micro (MDX-40, Roland o cualquier otra máquina de fresado CNC). PMMA maestro entonces se sonicated en alcohol isopropílico durante 10 minutos para eliminar los residuos.
  2. Las matrices de 2,5 micras de alta cresta estructuras se modelan en un 50,8 mm x 50,8 mm placa de vidrio por un proceso de fotolitografía estándar, seguido por el grabado húmedo del vaso.
    En primer lugar, matriz de estructuras cresta se modelan sobre un sustrato de vidrio limpia con un positivo S1818 fotosensible usando fotolitografía. S1818 es spin-revestido en el sustrato (4000 rpm), suave base a 110 ° C durante 5 minutos, y luego se exponen a la luz UV (84 mJ / cm 2) con un alineador de máscara seguido por el desarrollo de la fotoresistencia en MF319 de 40 segundos. A continuación, el sustrato de vidrio fotosensible patrón se encuentra inmersa en óxido de buffer de grabado (BOE) a temperatura ambiente durante 6-7 minutos para obtener un 2,5 micras de altura estructuras cresta. Finalmente, la capa fotosensible es removida con acetona y alcohol isopropílico, seguido por un enjuague en desionizada (DI).
  3. Sustrato de vidrio con micro-estructuras de cresta es caliente en relieve contra el capitán PMMA para la transferencia de sus patrones.
    En primer lugar, el maestro PMMA molde y sustratos de vidrio de forma manual alineados y colocados en una prensa en caliente. Entonces, la temperatura se eleva a 115 ° C. Una vez que la temperatura deseada, 0,5 toneladas de peso se aplica durante 5 minutos. Después de 5 minutos, la temperatura se enfría a 40 ° C y la presión es liberada. El maestro de PMMA se corta en un 50,8 mm x 50,8 mm de tamaño de bloque.
  4. PDMS pre-polímero (Sylgard 184) se mezcla con el endurecedor en la proporción de 10: 1 en peso.
  5. PMMA maestro se coloca dentro de un barril y la mezcla de PDMS se vierte en la parte superior del maestro PMMA para la fabricación de un maestro de PDMS. Luego se coloca en un desecador conectado a una bomba de vacío. PDMS derramado en la parte superior de PMMA maestro entonces se desgasifica durante 15 minutos para eliminar las burbujas generadas durante el proceso de mezcla de PDMS.
  6. Cuando las burbujas se eliminan, PDMS se coloca dentro de un horno de nivelado 85 ° C durante una hora para la polimerización.
  7. Una vez que esté completamente curado PDMS, PDMS maestro se despega del maestro PMMA y colocado dentro de un desecador con 2-3 gotas de triclorosilano y la aspiradora durante 15 minutos para cubrir la superficie de vapor PDMS maestro. Recubrimiento triclorosilano facilita la liberación de la final PDMS neuronas co-cultivo de los productos del maestro de PDMS. Después del recubrimiento, el maestro de PDMS es brevemente enjuagarse con alcohol isopropílico para remover triclorosilano excesiva, y se seca con N 2 gas.

Parte 2: la cultura Neurona replicación dispositivo

  1. PDMS pre-polímero (Sylgard 184) se mezcla con el endurecedor en la proporción de 10: 1 en peso.
  2. PDMS mezcla se vierte en la parte superior del maestro PDMS y desgasificar el interior de un desecador conectado a una bomba de vacío durante 15 minutos. Es importante no echar demasiado PDMS para que la estructura de 3,5 mm de alto PDMS en el maestro no está totalmente sumergido.
  3. Cuando las burbujas se eliminan, PDMS se coloca dentro de un horno de nivelado 85 ° C durante una hora para la polimerización.
  4. PDMS se saca del horno después de una hora y se deja a temperatura ambiente se enfríe. Entonces, PDMS dispositivos para el cultivo de neuronas se desprendió suavemente del maestro PDMS. Se quitó los dispositivos de PDMS se envuelven con parafilm para protegerlos de polvo o suciedad.
  5. Dispositivos de PDMS, envuelto con parafilm, se cortan en piezas individuales con un taladro equipado con una cuchilla.

Parte 3: montaje de dispositivos

  1. PDMS dispositivo cultura neurona se coloca dentro del limpiador de plasma y plasma se expone al aire durante 90 segundos para que la superficie del dispositivo de PDMS hidrofílico. Este tratamiento de plasma que facilitará microcanales que se llena de medios de cultivo después de la asamblea de poli-D-lisina sustrato recubierto.
  2. Dispositivos de tratamiento con plasma se sumergen en etanol al 70% durante 30 minutos para la esterilización y se esteriliza el interior de la bio-campana.
  3. Dispositivos esterilizados se sacan de un 70% de etanol y se seca con Millipore filtrada N 2 gas. Dispositivos de secado se colocan en la parte superior de poli-D-lisina de poliestireno recubierto de 6 pocillos placa de cultivo y se aplica presión leve para asegurar la estanqueidad entre el sustrato y el dispositivo.
  4. Los medios de cultivo se llena en el compartimiento de soma, seguido por el llenado de los seis axón / glía compartimentos. Es mejor dar a 1-2 minutos de pausa antes de llenar axón / glía compartimentos después de la adición de medios de cultivo para el compartimiento de soma para asegurarse de que no queden atrapadas burbujas dentro de los microcanales.
  5. Dispositivos de llenado con medio de cultivo se incuba dentro de una incubadora de 37 ° C durante la noche para enjuagar cualquier resto o residuo tóxico posible.

Parte 4: Célula de carga y las neuronas de oligodendrocitos-co-la cultura

  1. En el primer día del cultivo de células, células primarias de las neuronas del cerebro anterior a partir del día embrionario 16 a 18 ratas se cargan en el compartimiento de soma en una densidad de área de 500 células / mm 2. En primer lugar, los medios de cultivo tanto dentro como el compartimiento de soma y axón / glía compartimentos se aspiran con una pipeta antes de la carga de la célula. Luego, las células 38500, diluidas en 40 ml de medios de cultivo, se cargan en el compartimiento de soma alrededor de las entradas de microcanales. Es importante no tocar el dispositivo de PDMS durante la carga de las células, ya que puede romper el sello entre el dispositivo y el sustrato.
  2. Incubar los dispositivos celulares cargado durante 30 minutos dentro de una incubadora a 37 ° C para mejorar la adhesión celular al sustrato. Después de la incubación, todos los compartimientos son llenados con medio de cultivo.
  3. Las células se cultivan a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2 y sólo la mitad de los medios de cultivo se cambió a cabo cada 3-4 días.
  4. Después de 14 días de cultivo in vitro de neuronas, oligodendrocitos se añaden a los compartimentos axón / glía de co-cultivo. Oligodendrocitos, disecados de los hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley en el día postnatal 1-2, se añaden a cada compartimento axón / glía en una densidad de área de 1.000 células / mm 2. Antes de las células de carga, aproximadamente el 60% de medios de cultivo dentro de los compartimentos se aspiran con una pipeta. Se debe tener en cuenta no a tocar el substrato del fondo, ya que puede dañar la red axonal formado sobre el sustrato. Entonces, 6700 oligodendrocitos, diluida en 5 l de medio de cultivo, se añaden a los compartimentos axón / glía. Las células se incubaron durante 1 hora y los compartimientos son llenados con medio de cultivo.
  5. Las células se cultivan a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2 y sólo la mitad de los medios de cultivo se cambió a cabo cada 3-4 días durante dos semanas más.

Parte 5: Resultados del representante:

Cuando los experimentos se llevan a cabo correctamente, las células neuronales cargado en el compartimiento de soma localizarse cerca de las entradas y la capa de microcanal axonal comienzan a formarse dentro de los compartimentos axón / glía después de 1 semana de la cultura. Signo de la agregación de células neuronales en el interior del compartimiento de soma puede ser un indicio de que las células no son saludables. Al cargar los oligodendrocitos, después de dos semanas de cultivo de neuronas, el axón / glía compartimentos deben estar cubiertos con una capa densa de axones y oligodendrocitos se debe cargar en la parte superior de la capa axonal.

la figura 1
Figura 1. Ilustraciones esquemáticas de la microfluídica de alto rendimiento de varios compartimentos del SNC las neuronas co-cultivo de la plataforma. Corte transversal que muestra el aislamiento de los axones de soma neuronal y las dendritas, así como el aislamiento de fluidos entre los compartimentos con mínima diferencia de nivel de fluidos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

la figura 2
Figura 2. Fabricación y montaje de los pasos de varios compartimentos PDMS microfluidos co-cultivo de dispositivos. Cada dispositivo se ajusta a un bien de un sistema convencional de 6 pocillos placa de poliestireno de cultivo de células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

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Discussion

Hemos desarrollado un compartimiento multi-plataforma de co-cultivo para el estudio de los mamíferos del SNC axón-glia interacción. Axones del SNC se aislaron con éxito de cuerpos celulares neuronales / dendritas, y oligodendrocitos fueron co-cultivadas con éxito en el interior del dispositivo. La densidad de las neuronas puede ser modificado por las aplicaciones, pero una concentración demasiado baja o demasiado alta puede causar que las células mueran. Además, es importante cambiar sólo la mitad de los medios de cultivo para que las células o capa axonal en el sustrato no están dañados. Esperamos que este sistema será una herramienta poderosa para el estudio de CNS axón-glia redes de señalización in vitro y ofrecer un camino hacia una plataforma de alto rendimiento para los factores de crecimiento de detección de drogas o de los posibles candidatos que promueven la mielinización y la reparación de la mielina.

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Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Salud Mental (NIH / NIMH) de subvención # 1R21MH085267.

References

  1. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
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  3. Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
  4. Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).

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