Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

Biology

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Summary

Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

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Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (31), e1399, doi:10.3791/1399 (2009).

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Abstract

Vi presentiamo un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema per SNC in vitro assone-glia di ricerca interazione, capace di condurre fino a sei esperimenti indipendenti in parallelo per una maggiore throughput. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo di fabbricazione per creare dispositivi microfluidici con strutture su scala sia micro che macro all'interno del dispositivo stesso attraverso un unico soft-litografia processo, consentendo di fabbricazione di massa con buona ripetibilità.

Il multi-vano microfluidica co-coltura piattaforma è composta da un vano soma di neuroni e sei assone / glia scomparti per oligodendrociti (OLS). Il vano soma e assone / glia vani sono collegati da un array di assone-guida microcanali che funzionano come barriere fisiche per limitare soma neuronale nel vano soma, consentendo assoni a crescere in assone / compartimenti glia. OL caricato in assone / glia scomparti in grado di interagire solo con assoni ma non con soma neuronale o dendriti, permettendo localizzato assone-glia studi di interazione. I microcanali ha inoltre permesso l'isolamento fluidico tra i compartimenti, lasciando sei esperimenti indipendenti da condurre su un unico dispositivo per un throughput più elevato.

Soft-litografia con poli (dimetilsiloxano) (PDMS) è una tecnica comunemente utilizzata in microdispositivi biomedica. Serbatoi su questi dispositivi sono comunemente definiti dal punzonatura manuale. Anche se semplice, allineamento poveri e della natura in termini di tempo del processo rende questo processo non adatto quando un gran numero di serbatoi devono essere ripetutamente creato. Il metodo di nuova concezione non ha richiesto punzonatura manuale dei serbatoi, per superare tali limitazioni. In primo luogo, sette serbatoi (profondità: 3,5 mm) sono state effettuate su un poli (metilmetacrilato) (PMMA) con blocco della macchina di micro-fresatura. Poi, gli array di microstrutture cresta, fabbricato su un substrato di vetro, sono state a caldo in rilievo contro il blocco PMMA per definire microcanali che collegano il soma e assone / glia scomparti. Questo processo ha portato macro-scala serbatoi (3,5 mm) e scala micro-canali (2,5 micron) in concomitanza con un singolo master PMMA. Una replica PDMS che è servito come un maestro dello stampo sono stati ottenuti utilizzando soft-litografia e il dispositivo finale PDMS è stato replicato da questo maestro.

Neuroni primari da E16-18 ratti sono stati caricati al vano soma e coltivate per due settimane. Dopo una settimana di coltura cellulare, gli assoni attraversato microcanali e formato assonale unico strato di rete all'interno degli assoni / glia scomparti. Gli assoni sono cresciuti in modo uniforme in tutto sei assone / glia scomparti e OLS da P1-2 i ratti sono stati aggiunti degli assoni / glia scompartimenti a 14 giorni in vitro per la co-coltura.

Protocol

Parte 1: Preparazione di un master per stampo multi-comparto dei neuroni co-coltura fabbricazione del dispositivo

  1. Primo passo per fabbricare il maestro PMMA è quello di rendere vani 3,5 mm di profondità. Uno scomparto soma e sei assone / glia comparti sono definiti su un blocco di PMMA con una micro-macchina di fresatura (MDX-40, Roland o qualsiasi altra fresa CNC). PMMA master è poi sonicato in alcool isopropilico per 10 minuti per rimuovere i detriti.
  2. Array di 2,5 micron strutture cresta alta sono modellati su un 50,8 x 50,8 millimetri vetrino mm con un processo di fotolitografia standard, seguita da attacco a umido del vetro.
    In primo luogo, un array di strutture di crinale sono modellati su un substrato di vetro puliti con photoresist positivo S1818 con fotolitografia. S1818 è spin-rivestito sul substrato (4000 rpm), morbida base a 110 ° C per 5 minuti, e poi esposto alla luce UV (84 mJ / cm 2) utilizzando una maschera allineatore seguita attraverso lo sviluppo del photoresist in MF319 per 40 secondi. Successivamente, il vetro photoresist fantasia substrato viene immerso in ossido tamponata etch (BOE) a temperatura ambiente per 6-7 minuti per ottenere un 2,5 micron strutture crinale alto. Infine, lo strato di photoresist viene rimosso con l'acetone e alcool isopropilico, seguito da un risciacquo in deionizzata (DI).
  3. Substrato di vetro con micro-cresta strutture è impresso a caldo contro il capitano PMMA di trasferire i suoi modelli.
    In primo luogo, maestro stampo PMMA e substrati di vetro sono allineati manualmente e posta su un hot-press. Allora, la temperatura si alza a 115 ° C. Una volta che la temperatura desiderata viene raggiunta, 0,5 tonnellate di peso è applicato per 5 minuti. Dopo 5 minuti, la temperatura viene raffreddato a 40 ° C e la pressione viene rilasciata. Il master PMMA viene poi tagliato in a mm 50,8 x 50,8 blocco formato mm.
  4. PDMS pre-polimero (Sylgard 184) viene miscelato con il catalizzatore nel rapporto di 10: 1 in peso.
  5. PMMA master è inserito all'interno di una botte e la miscela PDMS si versa sopra il maestro PMMA per fabbricare un maestro PDMS. E 'poi messo in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto. PDMS versato sulla parte superiore del PMMA master è poi degassificati per 15 minuti per rimuovere le bolle generate durante il processo di miscelazione PDMS.
  6. Quando tutte le bolle vengono rimossi, PDMS viene messo all'interno di un forno livellato 85 ° C per un'ora per la polimerizzazione.
  7. Una volta PDMS è completamente guarito, PDMS master è staccato dal master PMMA e collocato all'interno di un essiccatore con 2-3 gocce di triclorosilano e pulita per 15 minuti a vapore rivestire la superficie PDMS master. Rivestimento triclorosilano facilita il rilascio della finale PDMS neurone co-coltura dispositivi dal master PDMS. Dopo il rivestimento, il maestro PDMS è brevemente sciacquato con alcool isopropilico per rimuovere triclorosilano eccessiva e asciugati con N 2 gas.

Parte 2: la replica di cultura Neuron dispositivo

  1. PDMS pre-polimero (Sylgard 184) viene miscelato con il catalizzatore nel rapporto di 10: 1 in peso.
  2. Miscela PDMS si versa sopra il maestro PDMS e degasato all'interno di un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto per 15 minuti. E 'importante non versare troppo PDMS in modo che la struttura di 3,5 mm di altezza PDMS sul master non è completamente immersa.
  3. Quando tutte le bolle vengono rimossi, PDMS viene messo all'interno di un forno livellato 85 ° C per un'ora per la polimerizzazione.
  4. PDMS è tolto dal forno dopo un'ora e lasciato a temperatura ambiente per raffreddare. Poi, PDMS dispositivi cultura neurone sono leggermente staccata dal master PDMS. Staccata dispositivi PDMS sono avvolte con parafilm per proteggerli dalle polveri e detriti.
  5. Dispositivi PDMS, avvolto con parafilm, vengono tagliati in pezzi singoli utilizzando un trapano a colonna dotato di una lama.

Parte 3: montaggio del dispositivo

  1. PDMS dispositivo cultura neurone è collocato all'interno del più pulito al plasma ed esposta a plasma ad aria per 90 secondi per rendere la superficie del dispositivo PDMS idrofilo. Questo trattamento al plasma faciliterà microcanali da riempire con terreni di coltura dopo il montaggio di poli-d-lisina substrato rivestito.
  2. I dispositivi trattati con plasma vengono poi immersi in etanolo al 70% per 30 minuti per la sterilizzazione e si è trasferito all'interno del sterilizzati bio-cappuccio.
  3. Dispositivi sterilizzati sono considerate fuori dal 70% di etanolo e asciugati con Millipore filtrata N 2 gas. Dispositivi essiccati sono messi in cima alla poli-d-lisina polistirolo rivestito da 6 pozzetti cultura e una leggera pressione si applica per garantire la tenuta tra il substrato e il dispositivo.
  4. Cultura dei media viene poi riempito nel vano soma, seguita da riempire sei assone / glia scomparti. E 'meglio dare 1-2 minuti di pausa prima di riempire assone / glia scomparti dopo l'aggiunta di terreni di coltura per il comparto soma per garantire che non bolle sono intrappolati all'interno della microcanali.
  5. Dispositivi pieno di terreni di coltura viene incubata all'interno di un incubatore a 37 ° C durante la notte per lavare i detriti possibile o residui tossici.

Parte 4: Cella di carico degli oligodendrociti e neuroni-co-coltura

  1. Il primo giorno della coltura cellulare, le cellule neuronali primarie proencefalo fin dal primo giorno embrionale 16-18 ratti sono caricati nel vano soma ad una densità areale di 500 cellule / mm 2. In primo luogo, terreni di coltura, sia all'interno del vano soma e assone / glia scomparti sono aspirati con pipetta prima del caricamento delle cellule. Poi, le cellule 38500, diluito in 40 ml di terreni di coltura, vengono caricati al vano soma in tutto il insenature microcanali. E 'importante non toccare il dispositivo durante il caricamento PDMS le cellule, in quanto può rompere il sigillo tra il dispositivo e il substrato.
  2. Incubare i dispositivi cellulari caricato per 30 minuti all'interno di un incubatore a 37 ° C per migliorare l'adesione delle cellule al substrato. Dopo l'incubazione, tutti i comparti sono riempite con terreni di coltura.
  3. Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e solo la metà dei terreni di coltura viene cambiato fuori ogni 3-4 giorni.
  4. Dopo 14 giorni di coltura in vitro in neuroni, oligodendrociti sono aggiunti l'assone / glia scomparti per co-coltura. Oligodendrociti, sezionato dagli emisferi cerebrali di ratti Sprague-Dawley al giorno postnatale 1-2, vengono aggiunti a ogni assone / glia vano ad una densità superficie di 1000 cellule / mm 2. Prima di celle di carico, circa il 60% dei terreni di coltura all'interno dei comparti sono aspirati con pipetta. Attenzione deve essere fatta a non toccare il substrato di fondo, dal momento che può danneggiare la rete assonale formata sul substrato. Poi, 6700 cellule oligodendrociti, diluito in 5 l di terreni di coltura, vengono aggiunti l'assone / glia scomparti. Le cellule vengono incubate per 1 ora e scomparti sono riempiti con terreni di coltura.
  5. Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e solo la metà dei terreni di coltura viene cambiato ogni 3-4 giorni fuori per altre due settimane.

Parte 5: Risultati Rappresentante:

Quando gli esperimenti siano state eseguite correttamente, le cellule neuronali caricati al vano soma localizzare vicino al insenature microcanali e strato assonale iniziare a formare dentro l'assone / glia scomparti dopo 1 settimana della cultura. Segno di aggregazione delle cellule neuronali all'interno del vano soma può essere un'indicazione che le cellule non sono sani. Quando si carica oligodendrociti dopo due settimane di cultura neurone, assone / glia comparti dovrebbe essere coperto con uno strato denso di assoni e oligodendrociti devono essere caricati sulla parte superiore dello strato assonale.

figura 1
Figura 1. Illustrazioni schematica della high-throughput microfluidica multi-vano SNC neuroni co-coltura piattaforma. Vista in sezione trasversale che mostra l'isolamento degli assoni neuronali da soma e dendriti e isolamento fluidico tra i compartimenti con minuti di differenza di livello fluidica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

figura 2
Figura 2. Fabbricazione e fasi di montaggio per il multi-comparto PDMS microfluidica co-coltura dispositivo. Ogni dispositivo si inserisce in un pozzetto di una convenzionale 6 pozzetti di coltura cellulare polistirolo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

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Discussion

Abbiamo sviluppato un multi-vano co-coltura piattaforma per lo studio dei mammiferi SNC assone-glia di interazione. Assoni del SNC sono state isolate con successo da cellule neuronali enti / dendriti, e gli oligodendrociti sono stati co-coltura con successo all'interno del dispositivo. La densità dei neuroni può essere variata da applicazioni, ma la concentrazione troppo bassa o troppo alta può indurre le cellule a morire. Inoltre, è importante cambiare solo la metà dei terreni di coltura in modo che le cellule o assonale strato sul substrato non siano danneggiati. Ci aspettiamo che questo sistema sarà un potente strumento per lo studio del SNC assone-glia di segnalazione delle reti in vitro e fornire un percorso verso una piattaforma high-throughput per lo screening dei fattori di crescita o farmaci candidati potenziali che promuovono la mielinizzazione e la riparazione della mielina.

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) concedere # 1R21MH085267.

References

  1. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
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  3. Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
  4. Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).

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