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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Biology

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Summary

Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

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Romanazzo, D., Ricci, F., Vesco, S., Piermarini, S., Volpe, G., Moscone, D., Palleschi, G. ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection. J. Vis. Exp. (32), e1588, doi:10.3791/1588 (2009).

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Abstract

Immunoassays sind eine gültige Alternative zu den teuren und zeitaufwendigen quantitative HPLC-oder GC-1, 2 Methoden für das Screening Erkennung von gefährlichen Mykotoxinen in Nahrungsmitteln. In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu fertigen und zu verhören einen elektrochemischen wettbewerbsfähigen enzyme linked immunomagnetische Assay, der auf die Verwendung von magnetischen Kügelchen als feste Unterstützung für den immunchemischen Kette 3 und Siebdruck-Elektroden als sensing-Plattform.

Unsere Methode zielt darauf ab, den Gesamtbetrag der HT-2 und T-2-Toxine, Mykotoxine aus der Trichothecene Familie und von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit 4 zu bestimmen. Der Einsatz eines Antikörpers Klon mit einer Kreuzreaktivität von 100% gegenüber HT-2 und T-2 ermöglicht die gleichzeitige Nachweis beider Toxine mit ähnlicher Empfindlichkeit 5.

Der erste Schritt unseres Tests ist die Beschichtung Schritt, wo wir immobilisieren HT2-KLH-Konjugat-Toxin auf die Oberfläche des magnetischen Kügelchen. Nach einem Blocking-Schritt notwendig, um unspezifische Absorptionen zu vermeiden, kann die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers die Konkurrenz zwischen immobilisierten HT-2-und HT-2-freien oder T-2 in der Probe vorhanden oder gelöst in einem Standard-Lösung.

Am Ende des Wettbewerbs Schritt, die Höhe des monoklonalen Antikörpers verknüpft die immobilisierten HT-2 ist umgekehrt proportional zur Menge des Toxins in der Probelösung.

Ein sekundärer Antikörper mit alkalischer Phosphatase (AP) bezeichnet wird verwendet, um die Bindung zwischen den spezifischen Antikörper und dem immobilisierten HT-2 offenbaren. Die abschließende Messung Schritt wird durch Fallenlassen eines Aliquots Magnetic-Bead-Suspension durchgeführt, das entspricht einer spezifischen Probe / Standard-Lösung auf der Oberfläche eines Siebdruck-Arbeitselektrode; magnetischen Beads immobilisiert und mit Hilfe eines Magneten genau unter dem platziert konzentriert Siebdruck-Elektrode. Nach zwei Minuten der Inkubation zwischen magnetischen Kügelchen und ein Substrat für AP, ist die enzymatische Produkt durch Differential-Puls-Voltammetrie (DPV) mit einem tragbaren Gerät (PalmSens) auch in der Lage, automatisch acht Messungen in einem Intervall von wenigen Sekunden starten erkannt.

Protocol

1) Blocking beschichteten magnetischen Kügelchen:

Gehen Sie wie folgt zu beschichteten magnetischen Kügelchen Block:

  1. Einen Satz von 2 ml Eppendorf-Röhrchen;
  2. Homogenisieren (Schütteln, aber nicht Vortexen) beschichteten magnetischen Kügelchen (siehe Anhang für die Herstellung von beschichteten magnetischen Kügelchen) mit der Probe rotierenden Mischer;
  3. Unmittelbar nach der Homogenisierung, Pipette 10 ul der beschichteten magnetischen Kügelchen in jedem einzelnen Eppendorf-Röhrchen;
  4. Add 1 ml Magermilch blockiert Lösung in jedes Eppendorf-Röhrchen des Satzes;
  5. Lassen magnetischen Beads für 30 min bei Raumtemperatur auf der rotierenden Probe Mischer inkubieren;
  6. Entfernen Blockierungslösung: dazu wird das Reagenzglas in magnetischen Partikel-Konzentrator mit den magnetischen Teil legte für 2 min (siehe magnetische Kügelchen kleben an der Seitenwand des Rohres); sorgfältig Pipette aus dem Überstand, so dass Perlen ungestört;
  7. 1 ml PBS-Puffer + NaN 3 + BSA als Storage-Lösung für jede Röhre;
  8. Shop beschichtet und blockiert magnetischen Beads bei 4 ° C (bitte beachten Sie, dass beschichteten magnetischen Kügelchen stabil sind für mindestens 2 Monate bei 4 ° C);

2) Immunologische Kette auf magnetische Kügelchen für den Bau der Kalibrierkurve und Analyse von Proben

Gehen Sie wie folgt an magnetische Kügelchen bereit für die Messung haben:

  1. Nehmen Sie eine Eppendorf-Röhrchen (2 ml) von beschichteten und blockierten Lösung für jede Probe zu extrahieren willst du zu analysieren sind;
  2. Ein Extra-Eppendorf-Röhrchen für jeden Arbeitstag Kalibrierlösung;
  3. Homogenisieren magnetischen Beads für 2 min auf der rotierenden Probe Mischer vor dem Einsatz;
  4. Entfernen Lagerflüssigkeit mittels magnetischer Partikel Konzentrator;
  5. Wash magnetischen Beads dreimal mit PBS / BSA Waschlösung. Entfernen Waschflüssigkeit;
  6. Wettbewerb Schritt: Fügen Sie für jedes Röhrchen mit den gewaschenen magnetische Kügelchen, 200 ul der Probe zu extrahieren vorbereitet, verwenden Sie eine Magnetic-Bead-Röhrchen für jede Probe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard-Lösung. Geben Sie 200 ul des monoklonalen Antikörpers Lösung für jedes Magnetic-Bead-Rohr. Lassen magnetischen Beads für eine halbe Stunde auf der rotierenden Probe Mischer bei Raumtemperatur inkubieren;
  7. Remove from Eppendorf-Röhrchen die Lösung für die Wettbewerbs-Schritt verwendet;
  8. Labeling Schritt: Fügen Sie 400μl der markierten sekundären Antikörper gegen jedes Magnetic-Bead-Eppendorf-Röhrchen. Lassen magnetischen Beads für eine halbe Stunde auf der rotierenden Probe Mischer bei Raumtemperatur inkubieren;
  9. Entfernen Sie die Kennzeichnung Lösung von Eppendorf-Röhrchen;
  10. Wash magnetischen Beads dreimal mit PBS / Tween ® 20 Waschlösung. Entfernen Sie die Flüssigkeit;
  11. Resuspendieren mit 100 &mgr; l der DEA-Puffer jedem Aliquot von magnetischen Kügelchen. Nun ist die magnetische Kügelchen sind bereit zur elektrochemischen Messung Schritt;

3) Montage von PalmSens mit Multiplexer (Mux) Optionen

Bitte beachten Sie: enzymatische Produkt Substrathydrolyse Fouls der Elektrodenoberfläche, aus diesem Grund eine neue Elektrode ist für jede Messung benötigt.

  1. Schließen Sie einen PC Laptop PalmSens über das serielle Kabel;
  2. Verbinden Sie den 9-DIN-Stecker des CH8 Multiplexer mit PalmSens.
  3. Schließen Sie serielle Kabel der Acht-Kanal Mux elektrischen Kontakt mit CH8 Multiplexer;
  4. Die Elektrodenspitze Streifen auf den acht Magneten blockieren. Achten Sie auf jeden Magneten unter jedem Arbeitstag Elektroden Ort (beachten Sie, dass die Notwendigkeit eines einzigen Magneten für jede Elektrode Imperativ sonst die magnetischen Partikel werden nicht auf der Arbeitselektrode Bereich konzentriert werden);
  5. Stecken Sie in Elektroden Streifen in Acht-Kanal-Mux elektrischen Kontakt;

Für DPV-Messung die folgenden Parameter in die entsprechenden Felder:
E beginnen: 0 (V); E Ende: 0,6 (V); E Schritt: 0,016 (V); E-Impuls: 0,0339 (V); E Konditionierung: 0 (V); E Deposition: 0 (V); Scan-Rate : 0,1 (V / s); T Puls: 0,06 (s); T Konditionierung: 0 (s); T Deposition: 0 (s); T Equilibrierung: 8 (s).

4) Die enzymatische Reaktion und elektrochemischen Messung

  1. Homogenisieren durch leichtes Schütteln jedes Eppendorf-Röhrchen mit magnetischen Beads bereit zur elektrochemischen Messung Schritt, um eine gut dispergierte Suspension von magnetischen Kügelchen zu erhalten;
  2. Pipette aus jedem Eppendorf, unmittelbar nach der Homogenisierung, ein Aliquot von 20 ul des Magnetic-Bead-Dispersion auf der entsprechenden Arbeitsgruppe Elektrodenoberfläche. Für jede Elektrode einen Streifen verwenden 20 ul magnetische Perlen aus verschiedenen Eppendorf-Röhrchen (zB für acht Elektrode verwendet acht verschiedene Eppendorf) übernommen;
  3. Add 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der ersten Elektrode. Start 2 min count down. Nach 14 sec, fügen Sie 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der zweiten Elektrode. Nach weiteren 14 sec, fügen Sie 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der dritten Elektrode. Gehen Sie zur gleichen Zeit intErval (14 Sekunden), bis der letzte Elektrode (das heißt: drop jedem Aliquot des Substrates mit Intervallen von 14 sec). Das Intervall von 14 Sekunden wird die Zeit durch den Potentiostaten um die Messung durchzuführen benötigt berechnet; der Anmerkung, die 80 ul Lösung auf jeden Sensor sollte die Arbeits-, Referenz-und Gegenelektrode zu decken. Darüber hinaus sollten die Lösungen für jeden Sensor nicht in Berührung kommen, mit Lösungen von benachbarten Elektroden.
  4. Nach dem 2 min Countdown von der ersten Zugabe von enzymatischen Substrat-Lösung, starten Sie den elektrochemischen Messung;
  5. Verwenden Sie die PalmSens Lite Software Stromspitzen (uA) für jede Lösung zu erhalten.

5) Berechnung

Stellen Sie eine Eichkurve mit einer logistischen 4 Parameter-Gleichung und berechnen Sie die Konzentration der gesamten HT-2/T-2 Toxin Menge in Nanogramm pro Milliliter für jedes Eppendorf-Röhrchen mit unbekannten Probe.

Die experimentellen Daten, Peakhöhe (uA) gegen die Konzentration der Kalibrierstandards (ng / ml), müssen ausgestattet mit einem nicht-linearen Vier-Parameter logistische (4-PL) Gleichung Grundstück (1) (mit Sigma Plot 8.0 oder sein Kaleidagraph). Die nichtlineare 4-PL-Modell ist in der Regel angenommen, um Ligandenbindungsassays (LBAs) 6 beschreiben.

Gleichung 1 (1)
a, b, x0, y0 sind logistische Parameter wie die Sigma Plot Kurvenanpassung Programms.
Verwenden Sie die Formel expliziert, um den Inhalt HT-2/T-2 Toxin Gesamtbetrag in der verdünnten Probe Extraktlösung berechnen
Gleichung 2 (2)
x ist die Massenkonzentration der Gesamtbetrag der HT-2/T-2 Toxine in die verdünnte Extrakt-Lösung, aus der Logistik-4 Parameter Gleichung in Nanogramm pro milliltre (ng / ml) berechnet
y wird der aktuelle Wert in uA für die unbekannte Probe erhalten

Appendix

6) beschichteten magnetischen Kügelchen

Gehen Sie wie folgt zu beschichteten magnetischen Kügelchen haben:

Waschverfahren

  1. Homogenisieren tosylactivated Dynabeads ® M-280 (Stammlösung 2 x 109 Beads / ml) durch Schütteln und Vortexen (max. Geschwindigkeit) für 1 min (Schaumbildung vermeiden) (bitte beachten Sie die Konzentration von magnetischen Kügelchen muss dabei immer die gleichen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten in der Messung);
  2. Unmittelbar Pipette 1 ml der oben homogenisiert Perlen in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen;
  3. Das Röhrchen wird in magnetische Partikel-Konzentrator mit den magnetischen Teil legte für 2 min (siehe magnetische Kügelchen kleben an der Seitenwand der Röhre);
  4. Sorgfältig Pipette aus dem Überstand, so dass Perlen ungestört;
  5. Entfernen Sie die Eppendorf-Röhrchen aus der magnetischen Partikel-Konzentrator und Resuspendieren der Beads in 1 ml 0,1 M Boratpuffer pH 9,5. Vorsichtig mischen für 2 min in der rotierenden Probe-Mischer für 2 min;
  6. Pipette aus dem Überstand;
  7. 1 ml Boratpuffer-Lösung in das Eppendorf-Röhrchen. Magnetic Beads sind nun bereit für die Beschichtung Schritt;

Coating Verfahren

  1. Add 600 ml HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) Stammlösung auf 1 ml der magnetischen Beads) (final HT-2-KLH-Konzentration von 375 mg / ml); inkubieren magnetischen Beads und HT-2-KLH-Lösung für 20h bei 37 ° C * mit langsamen Neigung Rotation auf rotierenden Probe Mischer;
  2. Nach der Inkubation wird das Reagenzglas in die magnetischen Partikel-Konzentrator und Pipette aus dem Überstand;
    Wash beschichteten Beads zweimal mit 1 ml PBS / BSA-Puffer-Lösung. Zwischen jedem Waschen entfernen PBS / BSA-Lösung. Alle Waschschritt durchgeführt Einstellung magnetischen Beads und PBS / BSA auf rotierenden Mischer für 5 min;
  3. Wash magnetischen Beads einmal mit 1 ml TRIS / BSA-Puffer-Lösung. Entfernen TRIS / BSA-Lösung. Führen Sie diesen Schritt, indem magnetischen Beads und TRIS / BSA-Puffer auf rotierenden Mischer für 4 h bei 37 ° C *;
  4. Wash magnetischen Beads einmal mit 1 ml aktualisiert (gehalten im Kühlschrank bei 4 ° C) PBS / BSA-Puffer-Lösung. Entfernen PBS / BSA-Lösung. Führen Sie diesen Schritt Einstellung magnetischen Beads und PBS / BSA-Puffer auf rotierenden Mischer für 5min bei Raumtemperatur;
  5. Nach dem Waschen Schritt entfernen Sie alle Waschflüssigkeit und 1 ml PBS-Puffer + NaN 3 + BSA als Speicher Flüssigkeit;
  6. Shop beschichteten magnetischen Kügelchen bei 4 ° C (bitte beachten Sie, dass beschichteten magnetischen Kügelchen stabil sind für mindestens 2 Monate bei 4 ° C);

* Zu diesem Zweck wird der Mischer in den Ofen mit einem Loch, die das Einführen des Kabels für die Stromversorgung ermöglicht ausgestattet ist. Alternativ kann der Mixer konnte in einem thermostatisierten Raum bei 37 ° C.

7) Probenvorbereitung und Extraktion

25 g fein gemahlene Probe (Babynahrung oder Müsli) sind wirighed in einen Mixbecher und extrahiert mit 100 ml Acetonitril / Wasser-Lösung (86/14) für 3 min in einem High-Speed-Mixer. Nach Zentrifugation bei 4000 rpm (3000 g) für 5 min, 8 ml des Überstands wurden entnommen und mit Mycosep Säule wurden 4 ml des gereinigten Extrakt unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Getrocknete Proben können bei -30 ° C gelagert werden bis zu mehreren Monaten.

8) Beispiel Rekonstitution

Frühstückscerealien

Bereiten Sie die getrockneten Frühstücksflocken-Extrakt (Lebensmittel mit Getreideflocken für erwachsene Verzehr bestimmt sind) mit 40 ml PBS pH 7,4. Auf diese Weise eine Probe mit einer Konzentration von Toxin gleich den vermeintlichen gesetzlichen Grenzwert (200 ng / g) wird in der Messung Schritt ein Signal geben, fällt in der Mitte des Arbeitsbereiches.

Babynahrung

Bereiten Sie die getrockneten Babynahrung Extrakt (Lebensmittel mit Getreideflocken für Kleinkinder Verzehr bestimmt sind) mit 4 ml PBS. Auf diese Weise eine Probe mit einer Konzentration von Giftstoffen in Höhe der angeblichen gesetzlichen Grenzwert (20-25 ng / g) wird in der Messung Schritt ein Signal geben, fällt in der Mitte des Arbeitsbereiches.

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Discussion

Die Verwendung von Antikörpern als biomolekularen Erkennung Sonde hat eine breite Anwendung zur Erfassung von Technologien gesehen; immunchemischen Nachweis Methoden, wie z. B. ELISAs und MEIAs sind heutzutage unter den am häufigsten verwendeten und angewandte Plattformen in vielen Labors 7.

Während diese Ansätze zu erzielen außergewöhnliche Sensitivität und Spezifität, ein primäres Ziel vieler Forschergruppen in den letzten Jahren hat sich der Verbesserung und Optimierung ihrer Darbietungen wurde.

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie zu fertigen und zu verhören einen elektrochemischen Immunosensor für Mykotoxin-Nachweis. Wir glauben, dass die Verwendung der Elektrochemie auf Immuno-basierende Sensoren entwickeln wird sich immer mehr an Bedeutung in der Zukunft sein. Dies ist aufgrund der inhärenten Vorteile der elektrochemischen Detektion über die optische eins. Elektrochemie ist in der Tat weniger anfällig für Störungen und hat sich als bemerkenswert robust gegen die unspezifische Adsorption und leistungsfähig, auch wenn in komplexen Proben-Matrizen wie Frühstücksflocken und Babynahrung in Frage gestellt. Darüber hinaus ist der Elektrochemie besser geeignet zur Miniaturisierung und zur Multi-Array-Anpassung.

Die Kopplung eines solchen Ansatzes mit magnetischen Nanopartikeln haben auch die analytischen Leistungen verbessert und haben sich als besonders für Kontaminanten in Lebensmitteln Erkennung Proben geeignet sein.

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Acknowledgements

Autoren möchten Nancy Downer und alle Mitglieder aus dem Labor für Analytische Chemie an der Universität Rom "Tor Vergata" Danke für ihre Mitarbeit und logistische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das EU-Projekt "Biocop" unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich S3264
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
MgCl2 anhydrous Sigma-Aldrich M8266
DEA (99.5%) Sigma-Aldrich 31589
HCl 37% Sigma-Aldrich 320331
H3BO3 Sigma-Aldrich B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane Sigma-Aldrich 252859
BSA (albumin bovine serum) Sigma-Aldrich A4503
NaOH Sigma-Aldrich S5881
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416
NaN3 Aldrich 71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt Fluka N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk Bio-Rad 170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): Biopure 004050 The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. Vector Laboratories AP-2000
HT-2 toxin Biopure
Magnetic beads: Dynabeads® Invitrogen M-280 Tosylactivated Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05% Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1% Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S Invitrogen
PalmSens instrument PalmSens Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer PalmSens
Eight channel Mux electric contact hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) hand made
Specially designed support for electrodes strip hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes. Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml. Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.

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References

  1. Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
  2. Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
  3. Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. 263-271 (2008).
  4. FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
  5. Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
  6. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9, (2), E260-E267 (2007).
  7. Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605, (2), 111-129 (2007).

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