ELIME Mycotoxin जांच के लिए विधि (एनजाइम इम्यूनो चुंबकीय विद्युत लिंक्ड)

Biology

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Summary

Trichothecenes मानव स्वास्थ्य के लिए चिंता का विषय (mycotoxins) एक नव विकसित स्क्रीनिंग एक प्रतियोगी immunochemical विधि और एक अंतिम विद्युत का पता लगाने के आधार पर विधि का उपयोग का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन है.

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Romanazzo, D., Ricci, F., Vesco, S., Piermarini, S., Volpe, G., Moscone, D., Palleschi, G. ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection. J. Vis. Exp. (32), e1588, doi:10.3791/1588 (2009).

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Abstract

Immunoassays अधिक महंगा है और समय लेने मात्रात्मक HPLC या 1 जीसी, खाद्य वस्तुओं में खतरनाक mycotoxins की स्क्रीनिंग का पता लगाने के लिए 2 तरीकों के लिए एक वैध विकल्प हैं. इस प्रोटोकॉल में हम बताते हैं कैसे बनाना और एक विद्युत प्रतिस्पर्धी एनजाइम पूछताछ लिंक्ड immunomagnetic immunochemical मंच संवेदन के रूप में 3 और श्रृंखला स्क्रीन मुद्रित इलेक्ट्रोड के लिए ठोस समर्थन के रूप में चुंबकीय मोतियों के उपयोग पर आधारित परख.

हमारे विधि HT-2 और टी 2 विषाक्त पदार्थों की कुल राशि, trichothecenes और मानव स्वास्थ्य के लिए 4 महान चिंता के परिवार के लिए संबंधित mycotoxins निर्धारित करना है. HT-2 और T-2 की दिशा में 100% की एक क्रॉस जेट के साथ एक एंटीबॉडी क्लोन के उपयोग के साथ ही साथ इसी तरह की संवेदनशीलता 5 दोनों विषाक्त पदार्थों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.

हमारे परख का पहला कदम कोटिंग कदम है जहाँ हम चुंबकीय मोतियों की सतह पर HT2 KLH संयुग्म विष स्थिर है. एक अवरुद्ध कदम है, गैर विशिष्ट absorptions से बचने के लिए आवश्यक के बाद, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के अलावा की अनुमति देता है immobilized HT-2 और मुक्त नमूना HT-2 या T-2 वर्तमान में या एक मानक समाधान में भंग के बीच प्रतिस्पर्धा है.

प्रतियोगिता कदम के अंत में, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की राशि से जुड़े immobilized HT-2 inversely नमूना समाधान में विष की राशि के लिए आनुपातिक हो जाएगा.

एक माध्यमिक alkaline फॉस्फेट (एपी) के साथ लेबल एंटीबॉडी विशिष्ट एंटीबॉडी और immobilized HT-2 के बीच बंधन प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंतिम माप कदम चुंबकीय मनका निलंबन की एक विभाज्य छोड़ने के द्वारा किया जाता है, एक विशिष्ट नमूना / मानक समाधान करने के लिए इसी, एक स्क्रीन मुद्रित काम कर इलेक्ट्रोड की सतह पर, चुंबकीय मोतियों immobilized और के तहत ठीक रखा चुंबक के माध्यम से ध्यान केंद्रित कर रहे हैं स्क्रीन मुद्रित इलेक्ट्रोड. चुंबकीय मोतियों और एपी के लिए एक सब्सट्रेट के बीच दो मिनट ऊष्मायन के बाद, enzymatic उत्पाद विभेदक पल्स (DPV) Voltammetry एक पोर्टेबल (PalmSens) साधन भी कुछ सेकंड के अंतराल के भीतर आठ स्वतः माप आरंभ करने में सक्षम का उपयोग कर के द्वारा पता लगाया है.

Protocol

1) लेपित चुंबकीय मोती अवरुद्ध:

आगे बढ़ें लेपित चुंबकीय मोतियों को ब्लॉक के रूप में पालन करें:

  1. 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों का एक सेट तैयार करना;
  2. Homogenize (मिलाते हुए नहीं बल्कि vortexing) लेपित चुंबकीय मोती (लेपित चुंबकीय मोतियों की तैयारी के लिए परिशिष्ट देखें) नमूना घूर्णन मिश्रक का उपयोग करते हुए;
  3. तुरंत homogenization के बाद, पिपेट प्रत्येक अलग Eppendorf ट्यूबों में लेपित चुंबकीय मोतियों की 10 μl;
  4. स्किम्ड सेट के प्रत्येक Eppendorf ट्यूब में दूध अवरुद्ध समाधान के 1ml जोड़ें;
  5. चुंबकीय घूर्णन नमूना मिक्सर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते मोती चलो;
  6. समाधान अवरुद्ध निकालें: ऐसा करने के चुंबकीय कण concentrator में चुंबकीय 2 मिनट (चुंबकीय ट्यूब की पार्श्व दीवार पर चिपके हुए मोती देखें) के लिए पर डाल भाग के साथ ट्यूब की जगह, ध्यान से बंद सतह पर तैरनेवाला पिपेट, मोती undisturbed छोड़ने;
  7. PBS बफर + 3 NaN + प्रत्येक ट्यूब के लिए भंडारण समाधान के रूप में BSA के 1 मिलीलीटर जोड़ें;
  8. 4 में लेपित और अवरुद्ध चुंबकीय मोतियों स्टोर डिग्री सेल्सियस (कृपया ध्यान दें है कि कम से कम 2 महीने के लिए लेपित चुंबकीय मोतियों 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं);

2) अंशांकन वक्र के निर्माण और नमूना विश्लेषण के लिए चुंबकीय मोतियों पर रोग प्रतिरक्षण श्रृंखला

आगे बढ़ें के रूप में माप के लिए तैयार करने के लिए चुंबकीय मोतियों का पालन करें:

  1. आप का विश्लेषण करने के लिए जा रहे हैं प्रत्येक नमूने निकालने के लिए लेपित और अवरुद्ध समाधान के एक Eppendorf ट्यूब (2 मिलीलीटर) ले लो;
  2. प्रत्येक कार्य calibrant समाधान के लिए एक अतिरिक्त Eppendorf ट्यूब ले लो;
  3. Homogenize उपयोग करने से पहले घूर्णन नमूना मिक्सर पर 2 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों;
  4. निकालें भंडारण तरल चुंबकीय कण concentrator का उपयोग;
  5. चुंबकीय मोतियों पीबीएस / BSA धोने समाधान के साथ तीन बार धोएं. तरल धोने निकालें;
  6. प्रतियोगिता कदम: प्रत्येक धोया चुंबकीय मोती, नमूने के 200μl तैयार निकालने वाले ट्यूब के लिए जोड़ें, प्रत्येक नमूना के लिए एक चुंबकीय मनका ट्यूब का उपयोग करें. प्रत्येक मानक समाधान के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. प्रत्येक चुंबकीय मनका ट्यूब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी समाधान के 200 μl जोड़ें. चुंबकीय मोतियों कमरे के तापमान पर घूर्णन नमूना मिक्सर पर आधे घंटे के लिए सेते हैं;
  7. Eppendorf ट्यूब से प्रतियोगिता के कदम के लिए इस्तेमाल किया समाधान निकालें;
  8. लेबल कदम: प्रत्येक चुंबकीय मनका Eppendorf ट्यूब लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के 400μl जोड़ें. चुंबकीय मोतियों कमरे के तापमान पर घूर्णन नमूना मिक्सर पर आधे घंटे के लिए सेते हैं;
  9. Eppendorf ट्यूब से लेबलिंग समाधान निकालें;
  10. चुंबकीय मोतियों पीबीएस / tween के साथ तीन बार ® 20 धोने के समाधान धो लें. तरल निकालें;
  11. डीईए बफर के चुंबकीय मोतियों के प्रत्येक विभाज्य 100μl साथ Resuspend. अब चुंबकीय मोतियों विद्युत माप कदम के लिए तैयार हैं;

बहुसंकेतक विकल्प (Mux) के साथ) 3 PalmSens के विधानसभा

कृपया ध्यान दें: सब्सट्रेट hydrolysis के enzymatic उत्पाद इलेक्ट्रोड सतह फ़ाउल, इस कारण के लिए एक नया इलेक्ट्रोड प्रत्येक माप के लिए की जरूरत है.

  1. सीरियल केबल के माध्यम से PalmSens के लिए एक पीसी लैपटॉप कनेक्ट;
  2. PalmSens साथ CH8 बहुसंकेतक 9 दीन प्लग कनेक्ट.
  3. CH8 बहुसंकेतक के साथ आठ चैनल Mux बिजली संपर्क के सीरियल केबल कनेक्ट;
  4. प्लेस आठ चुंबक ब्लॉक पर इलेक्ट्रोड पट्टी. ध्यान के प्रत्येक कार्य इलेक्ट्रोड के तहत एक चुंबक जगह (नोट के प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए एक एकल चुंबक की जरूरत है अन्यथा चुंबकीय कण काम कर इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित नहीं होगा आवश्यक है);
  5. आठ चैनल Mux बिजली के संपर्क में इलेक्ट्रोड पट्टी में प्लग;

DPV माप के लिए उचित बक्सों में निम्न पैरामीटर का उपयोग करें:
ई अंत; 0 (वी):: 0.6 (वी), ई कदम: 0.016 (वी), ई नाड़ी: ०.०३३९ (वी), ई कंडीशनिंग: 0 (वी), ई बयान: 0 (वी), स्कैन दर ई शुरू : 0.1 (वी / s), टी नाड़ी: 0.06 (ओं), टी कंडीशनिंग: 0 (एस), टी बयान: 0 (एस), टी संतुलन: 8 (ओं).

4) enzymatic प्रतिक्रिया और विद्युत मापन

  1. धीरे प्रत्येक Eppendorf क्रम में विद्युत माप कदम के लिए तैयार चुंबकीय मोतियों से युक्त करने के लिए चुंबकीय मोतियों की एक अच्छी तरह से छितरी निलंबन प्राप्त ट्यूब झटकों से homogenize;
  2. प्रत्येक Eppendorf से पिपेट, homogenization के तुरंत बाद, इसी काम कर इलेक्ट्रोड की सतह पर चुंबकीय मनका फैलाव के 20 μl के एक विभाज्य. प्रत्येक इलेक्ट्रोड अलग Eppendorf ट्यूब (आठ इलेक्ट्रोड उपयोग के आठ विभिन्न Eppendorf के लिए उदा) से ली गई है चुंबकीय मोतियों के 20 μl एक पट्टी उपयोग के लिए;
  3. पहली इलेक्ट्रोड पर एंजाइमी सब्सट्रेट समाधान के 80 μl जोड़ें. 2 मिनट उलटी गिनती प्रारंभ. 14 सेकंड के बाद दूसरे इलेक्ट्रोड पर एंजाइमी सब्सट्रेट समाधान के 80 μl जोड़ें. आगे 14 सेकंड के बाद तीसरे इलेक्ट्रोड पर एंजाइमी सब्सट्रेट समाधान के 80 μl जोड़ें. एक ही समय int पर आगे बढ़ेंपिछले इलेक्ट्रोड (: 14 सेकंड के अंतराल के साथ सब्सट्रेट के प्रत्येक विभाज्य ड्रॉप इसका मतलब है कि) तक erval (14 सेकंड). 14 सेकंड के अंतराल समय माप प्रदर्शन potentiostat द्वारा आवश्यक समय के रूप में गणना की है, नोट के प्रत्येक संवेदक पर 80 μl समाधान काम कर रहे, संदर्भ, और काउंटर इलेक्ट्रोड को कवर किया जाना चाहिए. इसके अलावा, प्रत्येक संवेदक के लिए समाधान पड़ोसी इलेक्ट्रोड के समाधान के साथ संपर्क में नहीं आना चाहिए.
  4. 2 मिनट के बाद एंजाइमी सब्सट्रेट समाधान के पहले इसके अलावा से नीचे गिनती, विद्युत रासायनिक माप शुरू;
  5. प्रत्येक समाधान के लिए वर्तमान चोटियों (μA) प्राप्त PalmSens लाइट सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.

5) गणना

एक अंशांकन वक्र एक रसद 4 मापदंडों समीकरण का उपयोग कर स्थापित और प्रत्येक Eppendorf अज्ञात नमूना युक्त ट्यूब के लिए मिली लीटर प्रति nanograms में कुल HT-2/T-2 विष राशि की एकाग्रता की गणना.

प्रयोगात्मक डेटा, calibrants (एनजी / एमएल) की एकाग्रता के खिलाफ पीक ऊंचाई (μA), एक गैर रेखीय चार पैरामीटर (4-पी एल) रसद समीकरण (1) साजिश (सिग्मा 8.0 प्लॉट या का उपयोग कर का उपयोग करके फिट किया जा Kaleidagraph). nonlinear मॉडल 4-पी एल आमतौर पर ligand बाध्यकारी (LBAs) assays 6 का वर्णन करने के लिए अपनाया है.

एक समीकरण (1)
a, b, x0, y0 रसद पैरामीटर के रूप में सिग्मा प्लॉट वक्र फिट कार्यक्रम के द्वारा दी गई.
पतला नमूना निकालने समाधान में HT-2/T-2 विष कुल राशि की सामग्री की गणना explicated सूत्र का उपयोग
2 समीकरण (2)
x पतला निकालने समाधान, milliltre प्रति nanogram में रसद 4 मापदंडों समीकरण (एनजी / एमएल) से गणना में HT-2/T-2 विषाक्त पदार्थों की कुल राशि का बड़े पैमाने पर एकाग्रता है
y μA में अज्ञात नमूने के लिए वर्तमान मूल्य प्राप्त है

परिशिष्ट

6) लेपित चुंबकीय मोती

आगे बढ़ो के रूप में लेपित चुंबकीय मोतियों का पालन करें:

प्रक्रिया धुलाई

  1. Tosylactivated Dynabeads homogenize ® एम 280 (शेयर 2 समाधान x 109 मनकों मिलीग्राम /) मिलाते और 1 (foaming बचने के) मिनट (कृपया ध्यान दें चुंबकीय मोतियों की एकाग्रता हमेशा एक ही में reproducibility सुनिश्चित की जरूरत के लिए vortexing (अधिकतम गति) ) माप;
  2. तुरंत एक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में ऊपर homogenized मोती के 1 मिलीलीटर विंदुक;
  3. चुंबकीय कण concentrator में चुंबकीय 2 मिनट (चुंबकीय ट्यूब की पार्श्व दीवार पर चिपके हुए मोती देखें) के लिए पर डाल भाग के साथ ट्यूब प्लेस;
  4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला पिपेट, मोती undisturbed छोड़ने;
  5. चुंबकीय कण concentrator से Eppendorf ट्यूब निकालें और 0.1 एम borate बफर पीएच 9.5 की 1 मिलीलीटर में मोती resuspend. 2 मिनट के लिए घूर्णन नमूना मिक्सर में 2 मिनट के लिए धीरे मिश्रण;
  6. बंद सतह पर तैरनेवाला पिपेट;
  7. पिपेट borate Eppendorf ट्यूब में बफर समाधान के एक मिलीलीटर. चुंबकीय मोतियों अब कोटिंग कदम के लिए तैयार कर रहे हैं;

कोटिंग प्रक्रिया

  1. सेते चुंबकीय मोतियों और HT-2-KLH समाधान के लिए; KLH (कीहोल लंगड़ाहट hemocyanin) चुंबकीय मोतियों की एक मिलीलीटर शेयर करने के लिए समाधान) (अंतिम HT-2-KLH 375 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एकाग्रता) के साथ HT-2 संयुग्मित की 600 मिलीलीटर जोड़ें 20 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस * नमूना मिक्सर घूर्णन पर धीमी झुकाव रोटेशन के साथ;
  2. ऊष्मायन जगह चुंबकीय कण और सतह पर तैरनेवाला बंद concentrator पिपेट में ट्यूब के बाद;
    लिपटे मोतियों पीबीएस / BSA बफर समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं. प्रत्येक धोने के बीच पीबीएस / BSA समाधान निकालने. सभी धोने कदम घूर्णन मिश्रक पर 5 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों और / पीबीएस BSA की स्थापना प्रदर्शन किया गया;
  3. चुंबकीय मोतियों Tris / BSA बफर समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर एक बार धोएं. Tris / BSA समाधान निकालें. 4 घंटे के लिए 37 मिक्सर घूर्णन पर चुंबकीय मोतियों और Tris / BSA बफर सेटिंग के द्वारा इस कदम कैर्री डिग्री सेल्सियस *;
  4. एक बार ताजा की 1ml (4 फ्रिज में रखा डिग्री सेल्सियस) पीबीएस / BSA समाधान बफर. उपयोग चुंबकीय मोतियों धो पीबीएस / BSA समाधान निकालें. इस कमरे के तापमान पर 5min के लिए मिश्रक rotating पर चुंबकीय मोतियों और पीबीएस / BSA बफर की स्थापना कदम कैर्री;
  5. धोने कदम सभी तरल धोने को हटाने और जोड़ने के बाद 1 मिलीलीटर PBS बफर + NaN 3 + BSA भंडारण तरल के रूप में;
  6. 4 में लेपित चुंबकीय मोतियों स्टोर डिग्री सेल्सियस (कृपया ध्यान दें कि लेपित चुंबकीय मोतियों कम से कम 2 महीने के लिए 4 में स्थिर रहे हैं डिग्री सेल्सियस);

* इस प्रयोजन के लिए मिश्रक एक छेद है जो बिजली की आपूर्ति के लिए केबल की प्रविष्टि की अनुमति देता है के साथ सुसज्जित ओवन में रखा है. मिक्सर वैकल्पिक रूप से 37 में एक thermostated कमरे में रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस

7) नमूना तैयार करने और निष्कर्षण

पतले जमीन के नमूने के 25 g (बच्चे को खाना या नाश्ता अनाज) हम कर रहे हैंएक ब्लेंडर जार में ighed और एक उच्च गति ब्लेंडर में 3 मिनट के लिए acetonitrile / पानी के घोल (86/14) के 100 मिलीलीटर के साथ निकाली गई. 5 मिनट के लिए 4000 rpm (3000 ग्राम), सतह पर तैरनेवाला के 8 मिलीग्राम लिया और Mycosep स्तंभ के साथ शुद्ध थे पर centrifugation के बाद साफ निकालने के 4 मिलीलीटर नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूख गया. -30 ° C पर सूखे नमूने संग्रहीत किया जा सकता है कई महीनों के लिए.

8) नमूना पुनर्गठन

नाश्ता अनाज

Reconstitute पीबीएस पीएच 7.4 की 40 मिलीलीटर के साथ सूख नाश्ता अनाज निकालने (अनाज आधारित खाद्य वयस्क खपत के लिए किस्मत में है). इस तरह माना कानूनी सीमा (200 एनजी / छ) के बराबर विष के एक एकाग्रता के साथ एक नमूना माप चरण में काम कर रहे सीमा के बीच में पड़ने के संकेत दे देंगे.

बेबी फ़ूड

Reconstitute पीबीएस के 4 मिलीलीटर के साथ सूखे बच्चे को खाना निकालने (अनाज आधारित खाद्य शिशु की खपत के लिए किस्मत में है). इस तरह चाहिए कानूनी सीमा (20-25 एनजी / छ) के बराबर toxins के एक एकाग्रता के साथ एक नमूना माप चरण में काम कर रहे सीमा के बीच में पड़ने के संकेत दे देंगे.

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Discussion

biomolecular मान्यता जांच के रूप में एंटीबॉडी का उपयोग संवेदन प्रौद्योगिकियों के लिए एक व्यापक प्रयोग देखा है, जैसे ELISAs और MEIAs immunochemical पता लगाने के तरीके, रहे हैं, आजकल कई प्रयोगशालाओं में 7 सबसे अधिक इस्तेमाल किया और लागू किया प्लेटफार्मों के बीच.

जबकि इन तरीकों पिछले वर्षों में असाधारण संवेदनशीलता और विशिष्टता, कई अनुसंधान समूहों के एक प्राथमिक उद्देश्य को प्राप्त करने के सुधार और उनके प्रदर्शन का अनुकूलन किया गया है.

इस प्रोटोकॉल में हम कैसे बनाना और mycotoxin पता लगाने के लिए एक विद्युत immunosensor पूछताछ से पता चला है. हम मानते हैं electrochemistry इम्युनो - आधारित सेंसर विकसित करने का उपयोग करने के लिए भविष्य में बढ़ते महत्व के साबित होगा. इस ऑप्टिकल एक से अधिक विद्युत का पता लगाने के निहित लाभ के लिए कारण है. Electrochemistry कम interferences के लिए प्रवण वास्तव में है और गैर विशिष्ट सोखना के खिलाफ उल्लेखनीय मजबूत और सिद्ध अच्छा प्रदर्शन जब भी नाश्ता अनाज और babyfood जैसे जटिल नमूना matrixes में चुनौती दी. इसके अलावा, electrochemistry miniaturization करने और बहु ​​सरणी के अनुकूलन के लिए अधिक उपयुक्त है.

चुंबकीय नैनोकणों के साथ इस तरह के दृष्टिकोण के युग्मन भी विश्लेषणात्मक प्रदर्शन में सुधार हुआ है और विशेष रूप से भोजन के नमूने में contaminants का पता लगाने के लिए अनुकूल साबित हो.

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Acknowledgements

लेखक के लिए विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, रोम के विश्वविद्यालय "टो Vergata" की प्रयोगशाला से उनके सहयोग और संभारतंत्रीय सहायता के लिए नैन्सी downer और सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम यूरोपीय संघ परियोजना "BioCop" द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich S3264
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
MgCl2 anhydrous Sigma-Aldrich M8266
DEA (99.5%) Sigma-Aldrich 31589
HCl 37% Sigma-Aldrich 320331
H3BO3 Sigma-Aldrich B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane Sigma-Aldrich 252859
BSA (albumin bovine serum) Sigma-Aldrich A4503
NaOH Sigma-Aldrich S5881
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416
NaN3 Aldrich 71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt Fluka N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk Bio-Rad 170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): Biopure 004050 The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. Vector Laboratories AP-2000
HT-2 toxin Biopure
Magnetic beads: Dynabeads® Invitrogen M-280 Tosylactivated Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05% Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1% Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S Invitrogen
PalmSens instrument PalmSens Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer PalmSens
Eight channel Mux electric contact hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) hand made
Specially designed support for electrodes strip hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes. Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml. Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.

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References

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  2. Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
  3. Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. 263-271 (2008).
  4. FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
  5. Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
  6. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9, (2), E260-E267 (2007).
  7. Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605, (2), 111-129 (2007).

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