आंशिक Ligation द्वारा अशांत प्रवाह प्रेरित माउस मन्या धमनी में Atherosclerosis और मन्या endothelium से एक शाही सेना के अलगाव की सरल विधि का एक माडल

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Summary

यह एक आंशिक मन्या ligation सर्जरी, जो intraplaque माउस आम मन्या धमनी में नव - vascularization (चार सप्ताह में) के साथ परेशान प्रवाह की स्थिति और बाद atherosclerosis के विकास (दो हफ्तों में) का कारण बनता है वर्णन किया गया है. हम भी मन्या intima से शाही सेना अलगाव के एक उपन्यास विधि का वर्णन है, उच्च शुद्धता endothelial शाही सेना प्रदान.

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Nam, D., Ni, C., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D. G., Giddens, D. P., Jo, H. A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium. J. Vis. Exp. (40), e1861, doi:10.3791/1861 (2010).

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Abstract

प्रसिद्ध निकट सहयोग के बावजूद, प्रत्यक्ष atherogenesis परेशान प्रवाह जोड़ने सबूत का अभाव रहा है. हमने हाल ही में मन्या आंशिक ligation के तरीकों का एक संशोधित संस्करण का इस्तेमाल किया है [1,2] को दिखाने के लिए कि यह तीव्रता कम और oscillatory प्रवाह की स्थिति, माउस आम मन्या धमनी में परेशान प्रवाह के दो प्रमुख विशेषताओं, लाती है. इस मॉडल का उपयोग करना, हम प्रत्यक्ष प्रमाण है कि परेशान प्रवाह वास्तव में अपोलीपोप्रोटीन ई पीटकर माउस में तेजी से और मजबूत atherosclerosis के विकास के लिए [3] सुराग प्रदान की है. हम भी उच्च शुद्धता के साथ माउस मन्या [3] intima से endothelial शाही सेना तैयार करने की एक विधि विकसित की. इस माउस मॉडल और पद्धति का उपयोग करके, हमने पाया है कि आंशिक ligation के एक सप्ताह में endothelial रोग का कारण बनता है, मजबूत और तेजी से दो सप्ताह में intraplaque neovascularization जैसे जटिल घाव गठन के चार सप्ताह के द्वारा सुविधाओं के साथ एक hyperlipidemic माउस मॉडल में atheroma गठन के द्वारा पीछा किया. यह तेजी

Protocol

1. बाईं मन्या धमनी की आंशिक ligation

  1. चूहे ~ उम्र के 8 सप्ताह में किया जाता है. चूहों का वजन कम से कम 18 ग्राम की सिफारिश की है.
  2. मनका साधन अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में 30 सेकंड के लिए उपकरणों जीवाणुरहित और शांत करने की अनुमति
  3. Ketamine (80mg/kg) और (10mg/kg) intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) या वैकल्पिक संज्ञाहरण के रूप में IACUC द्वारा अनुमोदित Xylazine के साथ संज्ञाहरण प्रेरित. आईपी ​​इंजेक्शन के लिए, पेट की बाईं कम वृत्त का चतुर्थ भाग में माउस इंजेक्षन.
  4. जब तक पूरी तरह से anesthetized वार्मिंग कक्ष में रखें माउस. चुटकी पैर की अंगुली करने के लिए प्रतिक्रिया के साथ संज्ञाहरण की गहराई सत्यापित करें.
  5. एक शल्य चिकित्सा मंच पर प्लेस (पेट तरफ ऊपर) लापरवाह स्थिति में, माउस. टेप पंजे - सामने हथेलियों और हिंद पंजे चरण के लिए नीचे एकमात्र.
  6. जबड़ा और उरोस्थि के बीच गर्दन लोमनाशक एजेंट (जैसे नायर) की उदार राशि लागू करें. धीरे मालिश जब तक सभी बालों को हटा दिया है.
  7. लोमनाशक एजेंट स्वच्छ और depilated क्षेत्र Betadine की उदार राशि लागू.
  8. 6-0 ligations के लिए रेशम सीवन के एक इंच लंबी वर्गों तैयार. प्रत्येक माउस सीवन के दो टुकड़े की आवश्यकता होगी.
  9. तेज छोटे कैंची का प्रयोग, 4-6mm गर्दन के बीच में खड़ी चीरा बनाते हैं. दोनों त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी के लिए कटौती की जानी चाहिए.
  10. Midline से बाईं ओर छोड़ दिया कर्णमूलीय ग्रंथि ले जाएँ और शुरू दो टूक ट्रेकिआ के सिर्फ सही विदारक. आप pulsating बाईं आम मन्या आसानी से पहचान करने में सक्षम होना चाहिए.
  11. आम मन्या caudally का पालन करें जब तक आप विभाजन का पता लगाने के लिए.
  12. दो टूक विभाजन के लिए बाईं आम मन्या धमनी बंद निम्नलिखित चार डिस्टल शाखाओं का पर्दाफाश: बाह्य मन्या धमनी, आंतरिक मन्या धमनी, पश्चकपाल धमनी और बेहतर थाइरोइड धमनी काटना. इन जहाजों, विशेष रूप से बेहतर थायराइड, नाजुक हो सकता है. बहुत ही अपने विच्छेदन के साथ सावधान रहें.
  13. 6-0 रेशम सीवन का उपयोग कर बेहतर थाइरोइड उपर्युक्त बाहरी मन्या बाँधो. ऐसा करने के लिए, धमनी के नीचे एक संदंश पास और अपने अन्य संदंश की मदद के साथ precut सिवनी का एक टुकड़ा हड़पने. धीरे सीवन खींचने के लिए धमनी के नीचे से गुजरती है. दृढ़ता से किसी भी आसपास गाँठ में पकड़ा जा रहा है ऊतक से बचने के बाँधो. यदि आप टाई नीचे बेहतर थाइरोइड धमनी की प्रक्रिया आप को प्रभावी ढंग से एक पूरी ligation है जो एक काफी अलग मॉडल है प्रदर्शन होगा के अंत तक ले.
  14. एक गांठ के साथ उसी तकनीक का उपयोग आंतरिक मन्या और पश्चकपाल धमनियों बाँधो.
  15. Sutures और बेहतर थाइरोइड धमनी की प्रत्यक्षता की स्थिति सत्यापित करें.
  16. लगभग त्वचा और करीब त्वचा ऊतक - ठीक कर लो की एक छोटी राशि का उपयोग कर.
  17. वसूली जब तक एक वार्मिंग कक्ष में रखें चूहों. वसूली आमतौर पर 30 से 60 मिनट लेता है.
  18. Buprenorphine (0.1mg/kg) के एक एकल खुराक तुरंत बाद सर्जरी दिलाई चाहिए अगर लंबे समय तक दर्द से राहत (ie. साँस isoflurane) प्रयोग किया जाता संज्ञाहरण प्रदान नहीं करता है या अगर जानवर पहले 24 घंटे के भीतर संकट में है. हमारे अनुभव में, Ketamine संज्ञाहरण के लिए प्रशासित खुराक पर्याप्त analgesia जब सर्जरी अनुभवी सर्जन द्वारा प्रदर्शन किया है और आगे कोई analgesia की जरूरत है प्रदान करता है.

2. कैरोटिड अल्ट्रासाउंड परीक्षा

  1. करने के लिए मान्य है कि आंशिक ligation के प्रवाह परेशान प्रेरित एक दिन बाद ligation, मन्या प्रवाह की जांच की जानी चाहिए
  2. Isoflurane साथ संज्ञाहरण प्रेरित संज्ञाहरण प्रेरण बॉक्स इस्तेमाल किया जा सकता है अगर जरूरत
  3. इमेजिंग मंच, पेट पक्ष पर anesthetized चूहों प्लेस
  4. टेप इमेजिंग मंच पर हथियार और पैरों ईसीजी सेंसर
  5. नायर के उदारवादी आवेदन (यह कदम केवल अगर ligation प्रक्रिया के लिए पहले से नहीं किया की जरूरत है) द्वारा गर्दन पत्तों से रहित करना
  6. गुदा थर्मामीटर डालें तापमान रिकॉर्ड
  7. गर्दन को जेल इको लागू
  8. बी मोड में प्रारंभ करें.
  9. इमेजिंग विमान 90 डिग्री (जांच पर घुंडी माउस के नाक की ओर बिंदु चाहिए) होना चाहिए
  10. माउस गर्दन पर जांच निचले जब तक छवि प्राप्त की है.
  11. मंच हेरफेर छोड़ दिया और सही (मध्य लाइन संरचना) ट्रेकिआ जब तक पहचान की है
  12. बाईं आम मन्या धमनी को पहचानें
  13. घुमाएँ इमेजिंग मंच इतना है कि एक कोण इमेजिंग विमान और मन्या के बीच बनाया है. अधिक से अधिक इस कोण, डॉपलर संकेत मजबूत हो जाएगा.
  14. प्लेस बाईं आम मन्या के बीच में पल्स लहर डॉपलर.
  15. कोण सुधार का उपयोग के रूप में की जरूरत है.
  16. सही आम मन्या पर माप दोहराएँ.
  17. सफल आंशिक मन्या ligation के प्रवाह में समग्र कमी (~ 80-90%) सही पक्ष के साथ तुलना में बाईं आम मन्या में महाधमनी इनलेट की ओर पाद लंबा दौरान प्रवाह के उत्क्रमण के साथ परिणाम होगा.
  18. एक बार संतोषजनक छवियों को प्राप्त किया गया है, बंद संज्ञाहरण बारी, चूहों और मुक्त चूहों बंद टेप Res के से जेल गूंज पोंछtraints. गरम वसूली कक्ष में चूहों रखें.

3. Intimal मन्या से शाही सेना अलगाव

  1. सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार बलिदान
  2. एक कागज तौलिया के पंजे टेप.
  3. पेट से छाती के ऊपर माउस के त्वचा कट.
  4. कैंची की एक तेज जोड़ी के साथ ribcage के पेट की दीवार के नीचे खोलें.
  5. संदंश के साथ उरोस्थि लिफ्ट और डायाफ्राम में कटौती, तो दूर दिल बेनकाब ribcage में कटौती.
  6. कैंची के साथ रग Cava कट.
  7. सामान्य नमक के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से 10 इकाइयों / एमएल हेपरिन युक्त जब तक फेफड़े और यकृत पीला हो गया है 2 से 3 मिनट के लिए दबाव perfuse (120 mmHg).
  8. गर्दन की त्वचा कट और सभी वसा, मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को दूर तक मन्या धमनियों को उजागर कर रहे हैं.
  9. एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत माउस रखें.
  10. दूसरा छिड़काव के लिए छोड़ दिया मन्या में ligation साइटों के ठीक नीचे एक छेद पंचर.
  11. सामान्य नमक के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से 10 इकाइयों / एमएल हेपरिन युक्त, सुनिश्चित करें कि बाईं मन्या में अच्छी तरह से perused है ~ 1 मिनट के लिए फिर से दबाव perfuse.
  12. ठीक एक टिप संदंश और छोटे वसंत कैंची का प्रयोग, ध्यान से पेरी adventitial carotids आसपास के ऊतकों को हटा दें. नहीं निचोड़ या इस कदम के दौरान सफाई carotids खिंचाव सावधान रहें.
  13. महाधमनी चाप और मन्या विभाजन ऊपर ligation के अंक के बीच बाईं मन्या धमनी कट.
  14. सही अवजत्रुकी धमनी शाखाओं में बंटी बिंदु और मन्या विभाजन के बीच सही मन्या धमनी कट.
  15. एक 35 मिमी संस्कृति डिश carotids स्थानांतरण, बहुत ठंडा HBSS युक्त. यदि आवश्यक हो, ध्यान से किसी भी शेष पेरी adventitial ऊतक निकालने.
  16. प्रत्येक मन्या प्रति 150 μl QIAsol lysis बफर (Qiagen) के साथ भरने के द्वारा एक 29g सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज (3 / 10 मिलीलीटर सिरिंज) की तैयारी.
  17. ध्यान से मन्या का एक अंत में सुई की नोक सम्मिलित करें.
  18. जबकि एक संदंश के साथ मन्या और सुई की नोक पकड़, जल्दी (~ 1 सेकंड) एक 1.5ml ट्यूब में QIAsol lysis बफर (150 μl) फ्लश (intima eluate).
  19. मन्या (मीडिया adventitia +) बचे हुए HBSS में एक बार, यह एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया, और तस्वीर तरल नाइट्रोजन में फ्रीज कुल्ला.
  20. Intima eluate और जमे हुए बचे हुए तो intimal या मीडिया + adventitia आरएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार miRNeasy मिनी किट (QIAGEN) का उपयोग अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

हम आंशिक रूप से ligated माउस छोड़ दिया मन्या धमनियों और अल्ट्रासाउंड परीक्षा से बाहर एक दिन प्रक्रिया के बाद किया गया. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, सफल आंशिक ligation के रक्त प्रवाह के वेग को कम कर देता है और छोड़ दिया आम मन्या धमनी में पाद लंबा दौरान प्रवाह (परेशान प्रवाह) पराजयों. ApoE पीटा (को) एक उच्च वसा वाले भोजन के साथ चूहों की आंशिक ligation बाईं आम मन्या धमनी (एलसीए) में मजबूत atherosclerosis लाती है, लेकिन contralateral सही मन्या में नहीं, दो सप्ताह (चित्रा 2). मन्या intima से एकत्र आरएनए PECAM-1 के रूप में endothelial मार्कर जीन होते हैं, जबकि औसत दर्जे चिकनी एक SMA (चित्रा 3) के रूप में मांसपेशियों सेल मार्कर जीन से मुक्त है.

चित्रा 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध मन्या शारीरिक रचना और ligations: बाईं आम मन्या धमनी की तीन शाखाओं (एलसीए) [बाह्य मन्या (ईसीए) धमनी, आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए), और पश्चकपाल धमनी (OA)] ligated थे, जबकि बेहतर थाइरोइड धमनी (एसटीए) को खुला छोड़.

चित्रा 2
चित्रा 2: अल्ट्रासाउंड छवियों प्रवाह वेग प्रोफाइल दिखाने के लिए और पता चलता है कि आंशिक ligation एलसीए में पाद लंबा दौरान प्रवाह उत्क्रमण (तीर द्वारा इंगित) लाती है . आरसीए में फ्लो ligation के बाद अपरिवर्तित बनी हुई है.

चित्रा 3
चित्रा 3: आंशिक ligation और उच्च वसा वाले आहार तेजी ApoE को चूहों के एलसीए में atherosclerosis लाती ApoE को चूहों थे आंशिक रूप से ligated और 1 से 3 सप्ताह के लिए उच्च वसा आहार खिलाया. . एलसीए से जमे हुए वर्गों तेल लाल ओ के साथ दाग थे.

चित्रा 4
चित्रा 4 intimal आरएनए तैयारी की विधि. Intimal शाही सेना और औसत दर्जे + adventitial (एम + एक) शाही सेना दिखावा संचालित आरसीए और एलसीए C57BL / 6 चूहों से प्राप्त किया गया. RNAs अर्द्ध मात्रात्मक (A) RT-पीसीआर और qPCR (बी, सी) द्वारा PECAM-1 और α-SMA के एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में 18s का उपयोग कर के लिए विश्लेषण किया गया. बार रेखांकन मतलब ± SEM n = 3 हैं.

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Discussion

इस प्रक्रिया में, बाह्य मन्या, आंतरिक मन्या, पश्चकपाल धमनी और बेहतर थाइरोइड धमनी सहित सभी आम मन्या की शाखाओं की उचित पहचान आवश्यक है. यह भी प्रवाह अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन पैटर्न को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे अनुभवी हाथों में, हमारे आंशिक ligation सर्जरी की सफलता की दर 500 से अधिक चूहों की अल्ट्रासाउंड के अध्ययन के आधार पर 90% की तुलना में बेहतर है. मन्या intimal शाही सेना की तैयारी के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रथम छिड़काव कदम के बाद मन्या की उपस्थिति के लिए ध्यान देना. अगर वहाँ इस बिंदु पर छोड़ दिया आम मन्या में प्रवाह रुकावट के सबूत है, हम इन नमूनों को आगे के विश्लेषण के लिए नहीं का उपयोग करने की सलाह देते हैं.

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Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान HL87012 (HJ) HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, महानिदेशक, HJ) और वर्ल्ड क्लास यूनिवर्सिटी परियोजना (HJ) से विज्ञान, प्रौद्योगिकी और दक्षिण कोरिया के शिक्षा मंत्रालय से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride) Baxter Internationl Inc. 2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) Tyco Healthcare, Covidien 8881600145
HBSS Cellgro 21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol) Qiagen 217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System VisualSonics, inc. a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice or similar system
6-0 Silk Suture, sterile Covidien s-1172 c2
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5675 or similar
Dissecting Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5005 or similar
Tissue Mend II Webster Veterinary 07-856-7946

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References

  1. Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23, (12), 2185-2191 (2003).
  2. Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22, (7), 1100-1105 (2002).
  3. Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297, (4), H1535-H1543 (2009).

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