Telomere जी की अधिकता संरचना की परीक्षा ट्रायपैनोसोमा brucei

Immunology and Infection
 

Summary

Telomeres गुणसूत्र स्थिरता के लिए आवश्यक हैं और telomere जी की अधिकता संरचना टेलोमिरेज की मध्यस्थता telomere रखरखाव के लिए आवश्यक है. हम हाल ही में telomere संरचना जी - अधिकता का पता लगाने के लिए दो तरीकों को अपनाया

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Sandhu, R., Li, B. Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (47), e1959, doi:10.3791/1959 (2011).

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Abstract

telomere संरचना जी की अधिकता खमीर, रीढ़, और ट्रायपैनोसोमा brucei सहित कई eukaryotes में पहचान की गई है. यह डी Novo telomere डीएनए संश्लेषण के लिए टेलोमिरेज के लिए सब्सट्रेट के रूप में में कार्य करता है और इसलिए telomere रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है टी.. brucei एक प्रोटोजोआ परजीवी है कि मनुष्यों और पशुओं में nagana में निद्रा रोग का कारण बनता है. एक बार संक्रमित स्तनधारी मेजबान, टी. brucei सेल नियमित रूप से इसकी सतह प्रतिजन स्विच करने के लिए मेजबान प्रतिरक्षा हमले से बचने के लिए. हमने हाल ही में दिखा दिया है कि टी. brucei telomere संरचना सतह प्रतिजन जीन की अभिव्यक्ति है, जो टी. के लिए महत्वपूर्ण है के नियमन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है brucei रोगजनन. लेकिन, टी. brucei telomere संरचना बड़े पैमाने पर नहीं किया गया है इस विशेष संरचना के विश्लेषण के लिए तरीकों की सीमा की वजह से अध्ययन . अब हम सफलतापूर्वक संकरण और ligation की मध्यस्थता telomere जी की अधिकता संरचना की परीक्षा और टी. में telomere टर्मिनल के दृढ़ संकल्प nucleotide के लिए एक adapter ligation विधि के लिए प्राइमर विस्तार तरीकों जेल में देशी अपनाया brucei कोशिकाओं. यहाँ, हम विस्तार में प्रोटोकॉल का वर्णन है और अपने अलग फायदे और सीमाएं तुलना.

Protocol

1. पता लगाएँ टी. brucei telomere मूल निवासी का उपयोग जी की अधिकता में जेल 3 संकरण

(चित्रा 1) सिद्धांत: देशी शर्त के तहत, एक लेबल के अंत (CCCTAA) 4 (TELC) oligo जांच केवल एकल असहाय telomere जी - अधिकता क्षेत्र संकरण कर सकते हैं . संकरण तीव्रता की अधिकता की लंबाई करने के लिए आनुपातिक है. विकृतीकरण और निराकरण के बाद, एक ही जांच पूरी telomere क्षेत्र संकरण करने में सक्षम हो जाएगा. संकरण तीव्रता कुल telomere डीएनए राशि का प्रतिनिधित्व करता है और एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रयोग के लिए दो मानक नियंत्रण अंत लेबल (TTAGGG) 4 (TELG) oligo जांच, जो टी. के रूप में कोई संकेत नहीं उपज चाहिए का उपयोग संकरण हैं brucei सेल telomere सी अधिकता संरचना नहीं है, करता है और 3'-विशिष्ट Exo मैं या Exo टी के रूप में एकल असहाय exonucleases साथ जीनोमिक डीएनए संकरण से पहले इलाज है, जो देशी TELC संकरण संकेत को खत्म करना चाहिए .

चरण 1. स्पंदित फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) के लिए डीएनए प्लग तैयार

बरकरार गुणसूत्रों PFGE द्वारा अलग किया जाएगा. इसलिए, जीनोमिक डीएनए डीएनए प्लग के रूप में तैयार है.

  1. खून फार्म कोशिकाओं के 100 एमएल (1.5 -२ मिलियन कोशिकाओं / एमएल) या procyclic कोशिकाओं (10 मिलियन कोशिकाओं / एमएल) की 20 एमएल के साथ शुरू करो.
  2. 1.6% कम गलनांक (LMP) एल बफर में agarose (0.01 एम Tris • सीएल पीएच 7.6, 0.02 एम NaCl, 0.1 एम EDTA पीएच 8.0) सी. और 50 पर इसे गर्म रखने के ° भंग
  3. द्वारा centrifugation krpm 1.5 हार्वेस्ट कोशिकाओं, 4 ° C 10 मिनट के लिए. एल 5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए बफर के साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें.
  4. 42-50 ° सी में 10 मिनट के लिए सेल निलंबन सेते हैं.
  5. कक्षों की एक मात्रा के एलएमपी agarose का 1 मात्रा जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स लेकिन जल्दी.
  6. विभाज्य सेल निलंबन के 85 μL एक डिस्पोजेबल प्लग मोल्ड (BioRad) के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए.
  7. 5-10 मिनट के बाद या जब तक प्लग जम कर रहे हैं, एक 15 एमएल 5 एमएल एल बफर / 1% Sarkosyl के साथ शंक्वाकार ट्यूब में हस्तांतरण प्लग. 250 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर या proteinase कश्मीर पाउडर की एक चुटकी के 100 μL जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और 50 में सेते ° C 48 घंटे के लिए.
  8. बफर त्यागें, एल बफर के 5 एमएल के साथ प्लग दो बार धोने और एक और 48 घंटे के लिए proteinase कश्मीर पाचन दोहराने. ताजा एल बफर के साथ प्लग फिर से धो लें. स्टोर 4 में प्लग डिग्री सी एल बफर. ये प्लग 2 हफ्तों के भीतर किया जाना चाहिए.

चरण 2. अलग बरकरार टी. brucei स्पंदित फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग गुणसूत्रों

  • Agarose जेल की तैयारी
    1. 0.5 x TBE बफर और CHEF DRII इकाई (BioRad) की जेल चला चैम्बर के लिए स्थानांतरण के 2-3 एल तैयार. चल रहे तापमान सेट, पंप शुरू हो, तो शीतलन इकाई शुरू.
    2. 0.5 x TBE बफर में एक 1.2% agarose जेल की 100 एमएल की तैयारी. कूल agarose जबकि जेल ट्रे की स्थापना.
    3. नमूना आदेश का फैसला. डीएनए मानक शामिल याद रखें. कंघी सूखी और यह एक सपाट सतह पर रखना. उपयुक्त दांत पर प्रत्येक डीएनए प्लग प्लेस. डीएनए प्लग आसपास आकांक्षा द्वारा अत्यधिक बफर ताकि प्लग दाँत के लिए छड़ी जाएगा निकालें.
    4. कंघी डालने के बिना agarose जेल डालो. यह 40-50 डिग्री सेल्सियस (कुछ मिनट) शांत करने के लिए, धीरे धीरे जेल में संलग्न प्लग के साथ कंघी सम्मिलित करें. यकीन है कि प्लग बंद कंघी नहीं स्लाइड. चलो जेल जमना. जेल से कंघी धीरे धीरे निकालें.
  • स्पंदित फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन
    700 s-1500 एस दालों, 2.5 वी / सेमी, 12 ° C 120 घंटे के लिए: एक CHEF DRII इकाई में जेल चलाएँ.

चरण 3. दाग और agarose जेल destain

तो कोमल कमाल के साथ 1 घंटे के लिए Ethidium ब्रोमाइड के बिना 0.5 x TBE में 1μg एमएल / आरटी पर 0.5 x TBE में 1 घंटे के लिए Ethidium ब्रोमाइड के साथ जेल दाग. जेल की एक तस्वीर ले लो.

चरण 4. Agarose जेल ड्राई

3 मिमी वाटमान कागज के दो परतों पर agarose जेल प्लेस और कवर प्लास्टिक लपेटो के साथ जेल. आरटी. (जेल 50 से अधिक डिग्री सेल्सियस डीएनए नमूनों के किसी भी विकृतीकरण से बचने के गर्म नहीं होना चाहिए) पर जेल ड्राई सुखाने के 2 और 4 बजे के बाद सूखी लोगों के साथ गीला वाटमान कागजात क्रमशः बदलें. सुखाने रखें जब तक जेल पूरी तरह से सूखा है. यह रातोंरात ले ड्रायर पर निर्भर करता है हो सकता है.

चरण 5. Oligo जांच लेबल

1 x 10 polynucleotide kinase (PNK) बफर, 5 की μL μL के साथ 50 एनजी / μL TELC या TELG oligo 1 μL मिक्स γ [32P] एटीपी, DDH 2 हे 2 μL, और टी -4 PNK 1 की μL . 37 में ° 1 घंटे के लिए सी सेते हैं. प्रतिक्रिया मिश्रण को TNES बफर (10 मिमी Tris सीएल, 8.0 पीएच, 100 मिमी NaCl, 10 मिमी EDTA, 8.0 पीएच, 1% एसडीएस) के 90 μL जोड़ें.

जबकि oligoes लेबलिंग, जी 25-स्तंभ तैयार: एक 3 सीसी सिरिंज में कुछ कांच ऊन डाल दिया है और यह सामान नीचे एक विंदुक टिप के साथ कसकर. ठीक जी 25 (autocl Sephadex साथ सिरिंज भरेंते में aved 3 एमएल निशान). चलो यह वजन से व्यवस्थित. लेबल जांच शुद्ध: स्तंभ के शीर्ष पर जांच लोड. TNES बफर के 700 μL के साथ धो, और TNES बफर के 600 μL साथ elute. वैकल्पिक रूप से, लेबल एक मिनी त्वरित स्पिन का उपयोग कर जांच शुद्ध ™ स्तंभ (Roche एप्लाइड साइंस).

संकरण: 6 कदम

  1. संक्षेप में आसुत जल में सूखे जेल गीला और दूर किसी भी वाटमान जेल पर अटक कागज धोने
  2. एक संकरण बैग में जेल प्लेस और hybridiztion बफर के 20 एमएल जोड़ने (0.25M ना 2 4 HPO pH7.2, 1 मिमी EDTA, 7% एसडीएस, 1% BSA, 0.22 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से फ़िल्टर्ड). पर एक पानी के स्नान में 50 डिग्री सेल्सियस कोमल कमाल के साथ कम से कम 1 घंटा के लिए सेते हैं.
  3. पूर्व संकरण बफर निकालें. 5 मिनट के लिए लेबल जांच उबाल लें और यह ताजा संकरण बफर के 25 एमएल जोड़ने के लिए, 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ मिश्रण को फिल्टर बाँझ और संकरण मिश्रण संकरण बैग को सीधे जोड़ने. सील बैग और गर्म पानी के साथ एक उथले कंटेनर में जगह. पानी के स्नान में पूरे कंटेनर रखें. 50 में कोमल कमाल के साथ डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
  4. संकरण बैग में एक छोटे से खोलने कट. बाहर के रूप में संभव संकरण मिश्रण के रूप में ज्यादा डालो और यह एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सहेजें. -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जांच रखें संकरण बैग से जेल निकालें और यह एक कंटेनर में डाल दिया.

    इस कदम पर सब कुछ गर्म हो और व्यापक सफाई (बेंच, परदे, कैंची, आदि. दस्ताने दोहरा परतों पहनें करने के लिए सुनिश्चित करें! की जरूरत होगी!
  5. 30 मिनट के लिए 4 x एसएससी में 50 बजे जेल धो डिग्री सेल्सियस ताजा धोने बफर के साथ बदलें और दो बार दोहराने.
  6. X 4 SSC/0.1% एसडीएस में 50 बजे जेल धो डिग्री सेल्सियस
  7. 3 मिमी वाटमान कागज के एक टुकड़े पर जेल रखो और हल्के जेल सूखी.
  8. लपेटें प्लास्टिक की चादर के साथ जेल और ~ 3 दिनों के लिए phosphorimager को बेनकाब
  9. Phosphorimager स्कैन
  10. आरटी पर denaturing बफर (1.5 एम NaCl, 0.5 एम NaOH) में 30 मिनट के लिए जेल सेते
  11. बेअसर बफर में जेल धो (3 एम NaCl, 0.5 एम • सीएल / 7.0 पीएच Tris) आरटी पर 30 मिनट के लिए
  12. 3 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला
  13. 1 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्री - संकरण
  14. संकरण ही जांच युक्त 55 ° रातोंरात सी संकरण मिश्रण का उपयोग कर दोहराएँ.
  15. 55 में धो के रूप में छोड़कर ऊपर वर्णित डिग्री सेल्सियस
  16. जेल लपेटें और ~ 2 बजे के लिए phosphorimager बेनकाब.
  17. Phosphorimager स्कैन. संकरण विकृतीकरण पहले विकृतीकरण के बाद प्राप्त के साथ प्राप्त संकेत सामान्यकरें.

2. Telomere टर्मिनल अडैप्टर 6 Ligation द्वारा nucleotide निर्धारित

(चित्रा 2A एवं 2B) सिद्धांत: एक 5 जी की अधिकता के अंत 'अंत लेबल अद्वितीय oligonucleotide 3 से ligated है. यह विशिष्ट पूरक गाइड oligo annealing द्वारा पूरा किया है. केवल अद्वितीय / गाइड oligo एडाप्टर असर telomere जी की अधिकता टर्मिनल दृश्यों के लिए संगत दृश्यों ligated जाएगा. टी. के लिए brucei, telomeres TTAGGG दोहराता के छह विभिन्न nucleotides के एक में समाप्त कर सकता है . इसलिए छह अलग गाइड oligoes (TG1 - TG6 2A चित्रा) उपयोग किया जाता है. Ligation के बाद, डीएनए प्रतिबंध endonucleases के साथ पचता है और एक agarose जेल पर हल.

  1. अद्वितीय oligo के kinase उपचार.
    10x PNK बफर के 3 μL के साथ 10 pmole / μL अद्वितीय oligo 6 μL मिक्स, 5 की μL γ [32] एटीपी, DDH 2 हे 14 μL, और टी -4 PNK के 2 μL (10 यू) पी . 37 में ° 1 घंटे के लिए सी मिश्रण सेते हैं.
  2. अनिगमित गर्म nucleotide निकालें.
    अनिगमित गर्म एटीपी हटाने और Elution बफर के 60 μL (अंतिम एकाग्रता ~ 1 pmole μL / होगा) के साथ अंत लेबल oligo elute Qiaquick nucleotide हटाने किट का उपयोग करें.
  3. गाइड oligo के लिए अद्वितीय oligo (एडाप्टर बनाने के लिए) पानी रखना.
    प्रत्येक गाइड oligo और एक μL annealing बफर (200 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0) के 2 μL अद्वितीय oligo शुद्ध 10 μL जोड़ें. 85 ° सी गर्मी ब्लॉक में ट्यूबों रखो और गर्मी ब्लॉक बंद. ट्यूब और गर्मी ब्लॉक आरटी शांत करने के लिए चलो. यह एक कुछ घंटे लगेंगे. यदि जल्दी हस्तांतरण ट्यूब में 5 65 मिनट प्रत्येक के बाद डिग्री सेल्सियस, तो 37 डिग्री सेल्सियस और फिर यह आरटी के लिए ठंडा.
  4. Ligate एडेप्टर जीनोमिक डीएनए कुल करने के लिए.
    बरकरार जीनोमिक डीएनए के 2.5 μL करने के लिए, 4 x 5 ligase बफर, annealed oligos के 10 μL, DDH 2 हे 2.5 μL, और टी -4 डीएनए ligase के 1 μL μL जोड़ने. 16 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
  5. प्रतिबंध endonuclease पाचन
    Ligation उत्पाद के 20 के लिए μL 3 x 10 ठोंग 4 बफर के μL, AluI और MboI प्रत्येक के 1.5 μL, और DDH ओ 2 के 4 μL जोड़ने 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात मिश्रण सेते हैं.
  6. वैद्युतकणसंचलन.
    प्रत्येक नमूने के लिए 10 x ऑरेंज जी डाई (50% ग्लिसरॉल, 0.5% ऑरेंज जी) के 3 μL जोड़ें. 0.5 x TBE में 0.2 μg / एमएल Ethidium ब्रोमाइड के साथ एक 20x20 सेमी 0.7% agarose जेल पर डीएनए के नमूने लोड. 30 मिनट के लिए 30V पर तब चलाएँ, गउच्च वोल्टेज लेकिन 120V की तुलना में 1000 ध् घंटा की कुल करने के लिए कम के साथ ontinue. एक डीएनए मार्कर के लिए अगले शासक साथ जेल की एक तस्वीर ले लो.
  7. ड्राई जेल और बेनकाब.
    DE81 फिल्टर पेपर और 3 मिमी वाटमान कागज के दो परतों की एक परत पर agarose जेल रखो और प्लास्टिक की चादर के साथ जेल कवर. आरटी पर सूखी जेल. सूखे रातोंरात phosphorimager जेल बेनकाब.

3. Ligation मध्यस्थता प्राइमर एक्सटेंशन 6

(चित्रा 2A एवं 2C) सिद्धांत: एक अनूठा oligonucleotide विशिष्ट टर्मिनल अनुक्रम के साथ 3 जी की अधिकता 'ligated है, एडाप्टर (गाइड) oligo में अपनी पूरक दृश्यों के द्वारा निर्धारित है. शुद्धि के बाद, लेबल गाइड oligo है कि G-overhang/unique oligo के लिए annealed रहता जंक्शन एस एस - डी एस के लिए विस्तारित टी -4 डीएनए पोलीमरेज़, जो कतरा विस्थापन और '5'-3 exonuclease गतिविधियों का अभाव का उपयोग प्राइमर है. प्राइमर विस्तार उत्पादों इसलिए जी की अधिकता के लंबाई दे.

  1. गाइड और अद्वितीय oligoes के kinase उपचार
    1. 10 x 10 PNK बफर, 20 μL x 5 ligase बफर (जो 10 मिमी एटीपी होता), 3 टी -4 PNK के μL (30 यू), और DDH 2 हे 47 μL μL के साथ 10 pmole / μL अद्वितीय oligo 20 μL मिक्स . 37 डिग्री 60 मिनट के लिए सी मिश्रण सेते हैं.
    2. 10 x PNK बफर, 2 की μL 1 की μL के साथ 10 pmole / μL गाइड oligo 1 μL मिक्स पी γ [32] एटीपी, 1 टी -4 PNK के μL (10 यू), और DDH 2 ओ 5 μL 37 डिग्री 60 मिनट के लिए सी मिश्रण सेते हैं.
  2. पानी रखना गाइड oligo और अद्वितीय oligo
    Phosphorylated अद्वितीय oligo और अंत लेबल पुस्तिका oligo (अद्वितीय के 2:1 के अनुपात oligo गाइड सुनिश्चित करता है कि सभी पुस्तिका oligo annealed है एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में 10 μL (10 pmole) (20 pmole) की 10 μL जोड़ें ). एक ही oligoes annealing के लिए प्रोटोकॉल द्वितीय में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें.
  3. Annealed गाइड / telomere समाप्त होता है के लिए अद्वितीय oligo एडाप्टर Ligate
    एक ही डीएनए ligation के लिए प्रोटोकॉल द्वितीय में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें.
  4. सोडियम एसीटेट के 1 / 10 मात्रा के साथ वेग डीएनए और -80 में 2.5 बर्फ ठंड इथेनॉल की मात्रा ° सी 30 मिनट के लिए. नीचे 15 मिनट के लिए डीएनए गोली स्पिन krpm, 12 4 ° C. इथेनॉल का 70% के साथ डीएनए धो और DDH 2 ओ के 10 μL में फूस भंग
  5. प्राइमर विस्तार
    प्रत्येक 10 μL डीएनए का नमूना 2 x 10 टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ बफर के μL, 1 1 मिलीग्राम / एमएल BSA के μL, 25 मिमी dATP, dCTP 1 μL, और प्रत्येक dTTP, 1 टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ की μL (3 यू) जोड़ने के लिए, और DDH 2 ओ के 3 μL
    पोलीमरेज़, बफर, आदि और विभाज्य मास्टर मिश्रण के प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए उचित मात्रा के साथ एक मास्टर मिश्रण बनाओ. 30 डिग्री 30 मिनट के लिए सी सेते हैं. फिर 0.5m EDTA के 1.2 μL तुरंत जोड़ प्रतिक्रिया.
  6. वैद्युतकणसंचलन
    एक 10% acrylamide / 7 एम urea/1xTBE जेल पर विस्तार उत्पादों चलाएँ. प्रत्येक नमूना के 4 μL लोड. नमूनों को लोड करने से पहले 10 मिनट के लिए उबाल लें. 1x TBE में 800V पर चलाएँ जब तक नीले डाई जेल के नीचे तक पहुँचता है. 65 में जेल सूखी डिग्री सेल्सियस आरटी पर 30 फिर 30 मिनट के लिए मिनट के लिए और 2 बजे के लिए phosphorimager बेनकाब.
    10% polyacrylamide जेल के 100 एमएल तैयार करने के लिए, आसुत जल का 30 एमएल में यूरिया की 41 ग्राम और 40% Acrylamide समाधान (acrylamide / बीआईएस - acrylamide 29:1) के 21 एमएल भंग, 10x TBE के 10 एमएल जोड़ें. गिलास प्लेट इकट्ठे. जेल डालने का कार्य करने से पहले ठीक है, 10% ए पी एस के 1 एमएल और TEMED के 100 μL जोड़ें. जेल डालो और किसी भी बुलबुले से बचने की कोशिश.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

पता लगाएँ टी. brucei telomere जी की अधिकता का उपयोग कर संरचना जेल में संकरण देशी

बरकरार टी. brucei PFGE द्वारा अलग क्रोमोसोम चित्रा 3A और 3B (बाएँ पैनल) में दिखाए जाते हैं टी.. brucei कोशिकाओं सामान्य ~ minichromosomes की 100 प्रतियां, सब समान आकार के साथ (50-150 केबी) होते हैं और जेल पर एक ही स्थिति (एमसी) की ओर पलायन. इस तथ्य के कारण, TELC oligo जांच, telomere जी की अधिकता संकेत minichromosomes (चित्रा 3A, मध्यम पैनल) पर सबसे प्रमुख है के साथ संकरण के बाद. TELG oligo जांच के साथ संकरण आमतौर पर किसी भी संकरण संकेत उपज नहीं है (चित्रा 3B, मध्यम पैनल) क्योंकि टी. brucei कोशिकाओं telomere सी अधिकता संरचना नहीं है. विकृतीकरण निराकरण और संकरण, के साथ या तो TELC या TELG oligo जांच के बाद सभी गुणसूत्र समाप्त होता है (चित्रा 3A और 3B, सही पैनलों) पर telomere संकेतों को प्रकट करना चाहिए.

Telomere टर्मिनल एडाप्टर ligation द्वारा nucleotide निर्धारित

प्रत्येक गली में डीएनए के बराबर राशि लोड हो रहा है इस परख के लिए आवश्यक है, और इस जेल के Ethidium ब्रोमाइड धुंधला द्वारा दिखाया गया है. चित्रा 4A, बाएं पैनल में एक उदाहरण दिखाया गया है.

इस प्रोटोकॉल में, अंत लेबल अद्वितीय oligo और गाइड oligo एडेप्टर केवल गुणसूत्र अंत तक ligated जब telomere दृश्यों कि गाइड oligo के साथ संगत कर रहे हैं के साथ समाप्त जी overhangs. सी nce अद्वितीय oligo अंत लेबल है, ligation उत्पाद रेडियोधर्मी हो और मजबूत संकेत दे. लेन 1, चित्रा 4A, राइट पैनल में दिखाया गया है एक मजबूत संकेत देता है, यह दर्शाता है कि unique/TG1 एडाप्टर की एक बड़ी राशि telomere अंत तक किया गया ligated है. TG1 5'CCCTAA3 'समाप्त अनुक्रम है. इसलिए telomere जी overhangs 5'TTAGGG3 में इस एडाप्टर अंत ligated. Ligation के उत्पादों की कोई महत्वपूर्ण राशि अन्य गाइड oligoes मनाया उपयोग कर रहा है, यह दर्शाता है कि TTAGGG में समाप्त telomeres में प्रमुख हैं टी. brucei कोशिकाओं.

Exo मैं या Exo टी, जो 3 'की अधिकता विशिष्ट न्युक्लिअसिज़ जीनोमिक डीएनए के साथ इलाज, ligation के उत्पादों की हानि (चित्रा 4A, सही पैनल, गलियों 2 & 3) में हुई, यह दर्शाता है कि ligation वास्तव में telomere से परिणामस्वरूप जी अधिकता संरचना

Ligation मध्यस्थता प्राइमर एक्सटेंशन

Ligation के बिना, अंत लेबल पुस्तिका oligo 22 NT के लंबा है. लोड हो रहा है अंत लेबल पुस्तिका oligo एक नकारात्मक नियंत्रण और एक आकार मार्कर के रूप में सेवा करेंगे. (चित्रा 4B, 11 लेन, तारांकन अंत लेबल इंगित करता गाइड oligo). हम आम तौर पर भी इस नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 4B, 11 लेन, खुला त्रिकोण), जो सबसे अधिक संभावना अवशेषों गैर विकृत एडेप्टर में ~ NT के 44 के एक बैंड का पालन. गुणसूत्र के अंत करने के लिए ligation के बाद, विस्तारित उत्पाद के आकार जी की अधिकता संरचना की लंबाई को दर्शाता है. हाल टी. 5'TTAGGG3 में brucei telomere अंत (4A चित्रा) जी overhangs '. हालांकि, इन जी - overhangs के बहुत ही कम हो (केवल ~ 10 NT के लंबे समय से) के रूप में उत्पादों ligated TG1 गाइड oligo से बढ़ाया गाइड oligo ही (चित्रा 4B, लेन 10) की तुलना में ज्यादा नहीं हैं दिखाई देते हैं, लेकिन वे के ligation की अनुमति TG1 अनुकूलक (चित्रा 4A, सही पैनल, 1 लेन). हालांकि केवल TG4 एडाप्टर की एक छोटी राशि telomere समाप्त होता है (चित्रा 4A, सही पैनल, 6 लेन) ligated था, ligated TG4 से बढ़ाया उत्पादों रहे हैं बहुत लंबे समय तक (चित्रा 4B, 7 लेन, तीर सिर) सबसे लंबे समय तक उत्पाद होने के साथ, ~~ 55 NT के. इसलिए, हम टी. में telomere के दो जी की अधिकता प्रकार मनाया brucei कोशिकाओं. 5'TTAGGG3 'में प्रमुख telomere जी overhangs लेकिन अंत में केवल ~ 10 NT के लंबे होते हैं. 5'GGGTTA3 में कुछ telomere अंत जी overhangs 'लेकिन लंबे समय nt 40 तक किया जा सकता है. Exo (या मैं Exo) उपचार (चित्रा 4B लेन 1, तीर 4A चित्रा, सही पैनल, लेन 2, 3, और 7) टी जी की अधिकता के दोनों प्रकार के प्रति संवेदनशील हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. देशी संकरण में जेल के सिद्धांत वाम, देशी शर्त के तहत, अंत लेबल TELC oligo जांच केवल एकल असहाय जी अमीर telomere की अधिकता के साथ संकरण कर सकते हैं. संकरण की तीव्रता telomere जी की अधिकता की लंबाई को दर्शाता है. ठीक है, विकृतीकरण के बाद, TELC oligo जांच सभी telomere डीएनए के साथ संकरण करेंगे. इस संकरण की तीव्रता telomere डीएनए की कुल राशि का प्रतिनिधित्व करता है और एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है, और अंतिम जी की अधिकता स्तर विकृतीकरण के बाद प्राप्त की है कि देशी संकरण संकेत विभाजित करके गणना की है.

चित्रा 2
चित्रा 2. अडैप्टर ligation और ligation मध्यस्थता प्राइमर विस्तार के सिद्धांत (ए) अद्वितीय और छह गाइड oligoes के अनुक्रम. (बी) telomere टर्मिनल एडाप्टर ligation द्वारा nucleotide का निर्धारण करते हैं. अद्वितीय oligo अंत लेबल (एक लाल तारांकन के साथ चिह्नित), गाइड oligoes annealed और telomere अंत करने के लिए ligated. जब केवल अद्वितीय / गाइड अनुकूलक एक 3 'की अधिकता है कि एडाप्टर ligated हो जाएगा टर्मिनल telomere अनुक्रम के साथ संगत है भालू. (सी) ligation मध्यस्थता प्राइमर विस्तार में, गाइड oligo है (एक लाल तारांकन के साथ चिह्नित) अंत लेबल और अद्वितीय oligo annealed पहले गुणसूत्र समाप्त होता है के लिए ligated. केवल अद्वितीय / गाइड '3 जी की अधिकता के साथ संगत की अधिकता असर एडाप्टर ligated जाएगा. ^ Ligated phophordiester बंधन इंगित करता है. Unligated oligo जोड़े को हटाने के बाद, प्राइमर विस्तार टी -4 डीएनए पोलीमरेज़, जो कतरा विस्थापन और '5'-3 exonuclease गतिविधियों का अभाव है के साथ बाहर किया जाएगा. विस्तारित पुस्तिका oligo के अंतिम लंबाई इसलिए जी की अधिकता के लंबाई को दर्शाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 टी.. brucei telomere जी की अधिकता संरचना विश्लेषण देशी द्वारा जेल में संकरण (ए) TELC oligo जांच के साथ संकरण में जेल. (बी) TELG oligo जांच के साथ संकरण में जेल. में दोनों (ए) और (बी) बाएँ, Ethedium ब्रोमाइड दाग PFG. मध्य, देशी संकरण परिणाम. ठीक है, संकरण के बाद विकृतीकरण परिणाम. जंगली - प्रकार टी. brucei कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया . बरकरार Exo या मैं जीनोमिक डीएनए इलाज PFGE द्वारा अलग हो गए थे. ओपन त्रिकोण megabase गुणसूत्रों के लिए खड़ा है, आईसी, मध्यवर्ती आकार के गुणसूत्रों, एम सी, minichromosomes.

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4 चित्रा टी.. brucei telomere जी की अधिकता संरचना ligation की मध्यस्थता प्राइमर विस्तार से विश्लेषण किया. (ए) हाल टी. brucei telomere जी overhangs 5'TTAGGG3 में समाप्त '. वाम, Ethedium ब्रोमाइड दाग डीएनए जेल. डीएनए के लगभग बराबर राशि प्रत्येक गली में भरी हुई है. ठीक है, सुखाने के बाद ही जेल के जोखिम परिणाम. बरकरार, Exo मैं का इलाज, या Exo डीएनए टी इलाज छह अलग अंत लेबल / अद्वितीय पुस्तिका oligo एडेप्टर ligated रूप में संकेत दिया था. (बी) टी. brucei telomeres के कम - जी overhangs है. छह अलग / अद्वितीय पुस्तिका oligo प्राइमर एक्सटेंशन का उपयोग टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा पीछा एडाप्टर को बरकरार या Exo टी इलाज जीनोमिक डीएनए ligated था. अंत लेबल TG4 oligo एक नकारात्मक नियंत्रण (11 लेन) के रूप में भरी हुई थी. खुद oligo 22 रन पर NT के (*) लेकिन यह भी ~ 44 NT के (Δ) में एक fainter संकेत दिया है. Unique/TG4 केवल एडाप्टर विस्तार उत्पादों अब काफी पुस्तिका oligo ही (तीर सिर, लेन 7) से मिले.

Discussion

ट्रायपैनोसोमा brucei के मानव में बीमारी सो का कारण बनता है . यह रोग, अगर अनुपचारित छोड़ दिया, अनिवार्य रूप से घातक है टी.. स्तनधारी सेनाओं में brucei कोशिकाओं प्रतिजनी भिन्नता नियमित रूप से इतनी के रूप में मेजबान प्रतिरक्षा 7 हमले से बचने के लिए गुजरना. इसलिए यह बहुत मुश्किल है टी. को खत्म करने एक बार एक संक्रमण brucei कोशिकाओं की स्थापना की है. हमने हाल ही में दिखा दिया है कि telomeres टी. की अभिव्यक्ति के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा brucei सतह प्रतिजन जीन 8. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए आगे टी. में telomere रखरखाव के लिए telomeres और तंत्र के कार्य को समझने brucei कोशिकाओं.

telomere जी की अधिकता संरचना टेलोमिरेज मध्यस्थता telomere रखरखाव 5 के लिए आवश्यक है . Telomere की अधिकता लंबाई मापने के लिए तरीके telomere रखरखाव के तंत्र के अध्ययन के लिए मूल्यवान हैं. हम सफलतापूर्वक संकरण तीन जेल में देशी अपनाया और ligation की मध्यस्थता प्राइमर एक्सटेंशन टी. विश्लेषण करने के लिए 6 विधि brucei telomere जी की अधिकता और telomere nucleotide टर्मिनल के निर्धारण के लिए adapter ligation विधि संरचना . दोनों जेल में देशी संकरण और अनुकूलक ligation विधि जी की अधिकता में सेल की कुल राशि को प्रकट कर सकते हैं, लेकिन केवल ligation मध्यस्थता प्राइमर विस्तार सटीक जी की अधिकता लंबाई प्रकट कर सकते हैं.

जेल संकरण में देशी के लिए, यह महत्वपूर्ण है तैयारी कदम भर में डीएनए नमूने नहीं denature. यह TELG oligo जांच के साथ डीएनए hybridizing द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. के बाद से वहाँ कोई सी telomere की अधिकता है, देशी TELG संकरण किसी भी संकेत है जब तक कि नमूने आंशिक रूप से विकृत कर रहे हैं उपज नहीं चाहिए. नमूना भी दो सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में जी अधिकता telomere किसी भी nuclease गतिविधि के लिए बहुत संवेदनशील है.

एडाप्टर ligation और प्राइमर विस्तार के लिए, oligoes शुद्ध साफ परिणाम. Exo टी मैं 3 'विशिष्ट अधिकता एकल असहाय डीएनए cleaving के लिए Exo की तुलना में अधिक प्रभावी है. Annealed नमूनों की समान लोड हो रहा है telomere की कुल राशि जी अधिकता की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम वैज्ञानिक विचार - विमर्श और व्यावहारिक सुझाव के लिए डा. कैरोलिन मूल्य धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NIH अनुदान AI066095 (: Bibo ली PI) के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SeaKem LE Agarose Lonza Inc. 50004
Agarose Type VII (low melting agarose) Sigma-Aldrich A4018
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche Group 03 115801001
Exo I New England Biolabs M0293
Exo T New England Biolabs M0265
T7 exonuclease New England Biolabs M0263
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203
QIAquick nucleotide removal kit Qiagen 28304

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References

  1. Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
  2. Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
  3. Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
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