L'esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare la struttura a sbalzo del telomero G. Nelle cellule di Brucey trappola. L'ibridazione nativa in gel utilizza una sonda oligo specifica per ibridare la regione a singolo filamento del telomero nella condizione nativa.

Questa regione a singolo filamento è la regione di sporgenza del telomero G e quindi la quantità di sonda oligo ibridata rappresenta il suo adattatore di lunghezza. La legatura consente di determinare la sequenza finale della sporgenza G del telomero quando l'oligo unico viene marcato. Questo metodo prevede la legatura di un adattatore specifico di sequenza all'estremità della struttura di sporgenza del telomero G per il saggio di estensione primaria mediata dalla legatura.

L'oligo guida viene marcato all'estremità e anale all'oligo unico prima di essere legato alle estremità del cromosoma. Dopo la legatura, l'estensione primaria viene eseguita utilizzando la T quattro DNA polimerasi. La lunghezza della sporgenza G può quindi essere determinata poiché il prodotto è n meno sei nucleotidi più lungo della sporgenza G effettiva, dove N rappresenta la lunghezza dell'oligo guida nell'adattatore.

Ciao, sono bi Bo, assistente professore presso il Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali della Cleveland State University. Ehi, sono Gio. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dr.Lee e oggi vi mostreremo una procedura per analizzare la struttura della matassa geografica.

Usiamo questa procedura per studiare la struttura e le funzioni dei telomeri in Trapasso mentre lavoriamo con la radioattività. Come in questo esperimento, è necessario prendere le dovute precauzioni di sicurezza. Il dipartimento istituzionale per la salute e la sicurezza ambientale dovrebbe essere consultato prima di tentare di farlo.

In questo video, alcuni di questi precursori sono assenti solo a scopo dimostrativo. Quindi iniziamo. Il principio di questa parte della procedura è che, in condizioni native, una sonda tell C non marcata comprendeva quattro ripetizioni di C-C-C-T-A.

Un oligo può ibridarsi solo nella regione di sporgenza del telomero G a singolo filamento. L'intensità di ibridazione è quindi proporzionale alla lunghezza dello sbalzo. Dopo la denaturazione e la neutralizzazione, la stessa sonda sarà in grado di ibridarsi all'intera regione dei telomeri.

L'intensità di questa ibridazione rappresenta la quantità totale di DNA dei telomeri e viene utilizzata come controllo del carico. Il livello finale di sporgenza G può quindi essere calcolato dividendo il segnale di ibridazione nativo per quello ottenuto dopo la denaturazione. Questa procedura inizia con una separazione dei cromosomi intatti mediante elettroforesi su gel di campo o PFGE, che richiede che il DNA genomico sia preparato in tappi agros per evitare di tranciare meccanicamente il DNA per realizzare questa prima dissoluzione a basso punto di fusione, o LMP agros in tampone L all'1,6% Mantenendolo caldo a 50 gradi Celsius, quindi raccogliere 200 milioni di cellule T brucey mediante centrifugazione.

Rimuovere il supinato e risospendere il pellet cellulare con il tampone L fino a una concentrazione finale di 5 milioni di cellule per millilitro. Incubare la sospensione cellulare tra i 42 e i 50 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere un volume di LMP all'1,6% a un volume di cellule e mescolare rapidamente ben aliquotare 85 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di uno stampo a tappo usa e getta.

Una volta solidificati i tappi, trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri con cinque millilitri di tampone L e cella sarco all'1%. Aggiungere un pizzico di proteinasi K in polvere. Mescolare bene e incubare a 50 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo l'incubazione, gettare il tampone e lavare due volte i tappi con cinque millilitri di tampone L. Quindi ripetere la digestione della proteinasi K nel tampone L ictus SAR caol per altre 48 ore. Lavare nuovamente i tappi con il tampone L fresco e conservarli a quattro gradi Celsius nel tampone L.

Questi tappi devono essere utilizzati entro due settimane. Preparare il gel agros con i tappi di DNA come descritto nel protocollo scritto. Quindi, eseguire il gel in una chef DR due unità.

Dopo PFGE, il gel viene colorato des macchiato fotografato e asciugato. Una volta che il gel è asciutto, metterlo in una sacca di ibridazione e aggiungere 20 millilitri di tampone di pre-ibridazione. Rimuovere quanta più aria possibile dal sacchetto e sigillare il sacchetto.

Incubare la sacca di ibridazione in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius con un leggero dondolo per almeno un'ora mentre si pre-ibrida l'etichetta in gel. Le sonde oligo incubano la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere 90 microlitri di tampone TNES alla miscela di reazione.

Per purificare la sonda etichettata, caricare la sonda sopra una colonna G 25 prefabbricata. Lavarlo con 700 microlitri di tampone TNAS ed eluire la sonda in 600 microlitri. Dopo la pre-ibridazione con gel, far bollire la sonda etichettata per cinque minuti e aggiungerla a 25 millilitri di tampone pre-ibridazione fresco.

Per creare il buffer di ibridazione, rimuovere il buffer di pre-ibridazione dal filtro a maniche. Sterilizzare la miscela di ibridazione con un filtro per siringa da 0,22 micrometri e aggiungerla direttamente nella sacca di ibridazione. Sigilla il sacchetto e mettilo in un contenitore poco profondo con acqua tiepida.

Metti l'intero contenitore nel bagnomaria a 50 gradi Celsius e incubalo per una notte con un leggero dondolo. Il giorno successivo, tagliare una piccola apertura nella sacca di ibridazione in un tubo conico da 50 millilitri. Versare la maggior parte possibile della miscela di ibridazione.

Mantenere la sonda congelata a meno 20 gradi Celsius. Rimuovere il gel dalla sacca di ibridazione e metterlo in un contenitore, lavare e asciugare il gel come descritto nel protocollo scritto. Una volta asciutto, avvolgere il gel con pellicola trasparente ed esporlo a una termocamera fosfoscopica per circa tre giorni.

Dopo tre giorni, eseguire la scansione dell'imager fosfogenico per eseguire l'ibridazione dopo la denaturazione. Iniziare incubando il gel in un tampone denaturante a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi lavare il gel e il tampone neutralizzante per 30 minuti.

Quindi, sciacquare il gel in acqua distillata per tre minuti. Pre-ibridare il gel a 55 gradi Celsius per un'ora. Ripetere l'ibridazione utilizzando la stessa sonda contenente la miscela di ibridazione di prima, ma a 55 gradi Celsius durante la notte dopo l'ibridazione.

Lavare e asciugare il gel come prima. Quindi avvolgere il gel ed esporlo a un imager fosfometrico per circa due ore. Scansione dell'imager fosfoscopico Infine normalizzare il segnale di ibridazione ottenuto prima della denaturazione con quello ottenuto dopo la denaturazione.

In questa parte della procedura, il T, il mero nucleotide terminale, viene determinato mediante legatura dell'adattatore. L'oligo unico è marcato all'estremità e all'estremità degli oligo guida e legato all'estremità dei telomeri. Solo quando l'adattatore guida unico ha una sporgenza di tre primi compatibile con la sequenza dei telomeri terminali, l'adattatore sarà legato.

Per T brucey. I telomeri possono terminare in uno dei sei diversi nucleotidi del TT, una ripetizione GGG. Pertanto, per iniziare questo processo vengono utilizzati sei diversi oligo guida.

Trattare l'oligo unico con chinasi mescolando sei microlitri da 10 mol per microlitro di oligo unico con tre microlitri di tampone PNK 10 volte, cinque microlitri di gamma P 32 A TP, 14 microlitri di acqua distillata doppia e due microlitri di T quattro PNK. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, utilizzare il kit di rimozione rapida dei nucleotidi per kayak per rimuovere l'A TP caldo non incorporato ed eluire.

L'estremità etichettata oligo con 60 microlitri di tampone di eluizione. Per ottenere una concentrazione finale di circa un P mol per microlitro per creare l'adattatore è necessario inginocchiare l'oligo unico all'oligo guida. Aggiungi 10 microlitri di oligo unico purificato a due microlitri di ciascun oligo guida e un microlitro di un tampone in ginocchio.

Metti i tubi in un blocco termico a 85 gradi Celsius e spegni il blocco termico. Lasciare raffreddare i tubi e il blocco termico alla temperatura RI per alcune ore. Quindi legare gli adattatori al DNA genomico totale.

Incubare la miscela a 16 gradi Celsius in una macchina per PCR durante la notte. Dopo un'incubazione notturna, eseguire una digestione endonucleasica di restrizione come descritto nel protocollo scritto. Aggiungere tre microlitri di colorante G 10 volte arancione a ciascun campione.

Caricare i campioni di DNA su un gel agros di 20 x 20 centimetri allo 0,7%. Far funzionare il gel a 30 volt per 30 minuti. Proseguire poi con una tensione più alta, mantenendo la tensione inferiore a 120 volt per un totale di 1000 volt in un'ora.

Dopo che il gel è stato eseguito, eseguire la scansione del gel colorante di bromuro AUM con lo scanner per tifoni. Infine asciugare il gel agros ed esporre il gel essiccato all'imager fosfoscopico durante la notte. Nell'estensione del primer mediato dalla legatura, l'oligo guida viene marcato all'estremità e collegato all'oligo unico prima di essere legato solo alle estremità del cromosoma.

Verrà legato l'esclusivo adattatore di guida con una sporgenza a tre numeri primi compatibile con la sporgenza G. Dopo la rimozione delle coppie di oligo non legate, l'estensione primaria può essere effettuata con T quattro DNA polimerasi, che manca di spostamento del filamento e di attività endonucleasica da cinque prime a tre prime. La lunghezza finale dell'oligo guida esteso riflette quindi la lunghezza della sporgenza G.

Per iniziare la chinasi di estensione del primer mediata dalla legatura, trattare l'oligo unico e l'oligo guida incubare entrambe le miscele a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Aneel l'oligo guida e l'oligo unico combinando 10 microlitri dell'oligo unico fosforilato e 10 microlitri dell'oligo guida marcato all'estremità in un tubo einor da 1,5 millilitri, Anil gli oligo e legare la guida Anil. L'esclusivo adattatore oligo alle estremità dei telomeri come descritto in precedenza, precipita il DNA ed esegue l'estensione primaria come descritto nel protocollo scritto.

Preparare un gel TPE al 10% di acrilammide, sette molari di urea una volta per eseguire i prodotti di estensione. Caricare quattro microlitri di ciascun campione pre-bollito con l'aggiunta di colorante sul gel. Far funzionare il gel a 800 volt in una volta TBE fino a quando il colorante blu raggiunge il fondo del gel.

Successivamente rimuovere il gel dalla lastra di vetro. Impostare l'essiccatore per gel in modo che mantenga una temperatura di 65 gradi Celsius per 30 minuti e asciugare il gel, continuare ad asciugare per altri 30 minuti dopo che l'essiccatore per gel è tornato a temperatura ambiente, infine esposto all'imager fosfoscopico per due ore. Vengono mostrati i cromosomi tbrc intatti separati da PFGE.

Le cellule T Brucey contengono normalmente circa 100 copie di mini cromosomi, tutti di dimensioni simili che migrano nella stessa posizione sul gel. A causa di questo fatto dopo l'ibridazione con la sonda oligo TC, il segnale di sporgenza G dei telomeri è più prominente sui mini cromosomi. Dopo la denaturazione e la neutralizzazione, l'ibridazione con la sonda oligo TLC rivela segnali telomeri su tutte le estremità dei cromosomi.

L'ibridazione con la sonda oligo TLG normalmente non produce alcun segnale di ibridazione perché le cellule T brucey non hanno strutture di sporgenza del telomero C. Dopo la denaturazione e la neutralizzazione, l'ibridazione con la sonda oligo Tel G rivela anche segnali telomeri su tutte le estremità dei cromosomi. Il caricamento di quantità uguali di DNA in ciascuna corsia è essenziale per determinare il nucleotide terminale del telomero mediante il saggio di legatura dell'adattatore e ciò è dimostrato dalla colorazione con bromuro di dio del gel in questo protocollo, l'oligo unico etichettato all'estremità e gli adattatori oligo guida sono legati solo alle estremità del cromosoma con la sequenza di sporgenza g del telomero compatibile con un oligo guida.

Poiché l'oligo unico è marcato all'estremità, il prodotto della legatura sarà radioattivo e darà un segnale forte. La corsia uno emette un segnale forte che indica che una grande quantità di adattatore TG one unico è stata legata all'estremità del telomero. TG one ha una sequenza finale di C-C-C-T-A, quindi il telomero g sporge legato a questo adattatore ed è TT A GGG.

Non si osserva una quantità significativa di prodotto di legatura utilizzando altri oligo guida, indicando che i telomeri che terminano in TT A GGG sono predominanti nelle cellule T brucey. Il caricamento dell'oligo guida marcato all'estremità funge da controllo negativo e da marcatore di dimensione senza legatura. L'oligo guida marcato all'estremità è lungo 22 nucleotidi.

La banda a circa 44 nucleotidi è molto probabilmente l'adattatore residuo non denaturato dopo la legatura all'estremità del cromosoma. La dimensione del prodotto esteso riflette la lunghezza della struttura a sbalzo G. La maggior parte delle sporgenze G del telomero di T brucey terminano in TT A GGG.

Tuttavia, queste sporgenze G sembrano essere molto corte a circa 10 nucleotidi. Poiché i prodotti estesi dal TG ligato, un oligo guida non è molto più lungo dell'oligo guida stesso, anche se solo una piccola quantità di adattatore TG quattro è stata legata alle estremità dei telomeri, i prodotti estesi dal TG quattro legato sono molto più lunghi con il prodotto più lungo di circa 55 nucleotidi. Quindi due tipi di strutture di sporgenza dei telomeri G sono state osservate nelle cellule tbrc.

Se la legatura deriva effettivamente dalla struttura di sporgenza del telomero G, il trattamento del DNA genomico con XO one o XOT, che sono tre nucleasi specifiche di sporgenza primaria, dovrebbe comportare la perdita dei prodotti di legatura. Entrambi i tipi di strutture a sbalzo G sono sensibili a tale trattamento. Ti abbiamo appena mostrato come analizzare la struttura del giang dei telomeri nel trapasso bru.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di caricare la stessa quantità di campioni in ciascuna corsia. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.