내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

Biology

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Summary

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

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Asai, A., Sahani, N., Ouchi, Y., Martyn, J., Yasuhara, S. In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy. J. Vis. Exp. (4), e210, doi:10.3791/210 (2007).

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Abstract

배경 : 규제 요인 및 생체내의 엑기스에 대한 자세한 생리가 남아있어 완전히 이미지가 발명했다 다양한 modalities 후 명확히하지 않습니다. 혈액 흐름의 많은 매크로 매개 변수는 유속, 혈액 흐름 속도와 적혈구 세포 (RBC)의 변화를 반영하는 동안 흐름은 현미경 관찰에 선형 관계를 보유하지 않습니다. RBC 속도와 RBC 플럭스, RBC 자속 및 플라즈마 흐름 볼륨 사이에, 그리고 현미경 관찰, 사용 microcirculatory 규정에 자세한 연구의 요구에 대해 과학적 근거에 주변 조직의 흐름을 규제의 공간 및 시간적 이질의 차이가보고있다 intravital 현미경.

방법 : 우리는 마우스 sternomastoid 근육의 생체내 미세 관찰의 제프 Lichtman의 방법을 수정했습니다. 마우스가 anesthetized 있으며, 환기, 그리고 현미경 관찰을위한 PKH26L - 찬란 분류 RBCs 주사.

결과 및 결론 : 찬란 분류 RBCs가 감지하고 넓은 분야 현미경으로 잘 구분할 수 있습니다. 근육 수축은 RBC 유동적 전기 자극을 유발 증가 evoked. RBC의 속도와 모세관 밀도 등 다른 매개 변수의 부량이 가능했다. 마우스는 잘 수술, 스테인드 RBCs의 주입, 현미경 관찰, 전기 자극을 용납. 아무도 근육이나 혈관 손상은 우리의 방법은 상대적으로 덜 침습 장기 관찰에 적합 것을 제안, 관찰되지 않았습니다.

Protocol

RBC 막 염색법

  1. 마우스 붉은 혈액 세포 heparinization과 같은 마우스 변형에서 수정되었습니다.
  2. 마우스 RBC는 PKH26 염료 (; 레드 형광 세포 링커 키트, 시그마, 미국 567분​​의 551 NM)와 스테인드되었습니다.
  3. RBC는 PBS로 씻어하고 실온에서 5 분 PKH26 염료의 2μM 솔루션 incubated되었습니다. 반응은 플라즈마를 추가 (열 65 ° C 사전에서 1 시간 동안 inactivated)과 1 분 incubated에 의해 중지되었습니다.
  4. 스테인드 RBC는 PBS로 5 번 씻어했다.

마우스 준비

  1. 3 ~ 6 달이 넘은 남성 C57BL/10 생쥐는이 연구에 사용되었다. 우리 pentobarbital의 intraperitoneal 주입 (50mg/kgBW)에 의해 anesthetized 마우스.
  2. 생쥐는 다음 20 게이지 폴리에틸렌 튜브로 intubated 기계적 환기, 그리고 37 기까지했다 ° 열전대 센서와 피드백 온도 컨트롤러 시스템에 연결된 Kapton 시트 히터에 C.
  3. 목 복부 측면을 면도했다. 좌우 sternomastoid 근육이 노출되었습니다. 근육은 스테인레스 스틸 홀더 지원 및 살균 크렙스 링어 솔루션 superfused되었습니다.

주사

  1. 스테인드 RBCs는 37 크렙스 링어에 희석 ° C에서 예열했다. 스테인드 RBC (혈소판 12 %)의 50ul는 성기 정맥에서 마우스에 주입했다.

골격 근육의 생체내 미세 전망대에서

우리는 수정 1 제프 W. Lichtman의 방법을 따라 :

  1. 동물은 니콘 이클립스 - 800 현미경의 손으로 만들어진 철 무대 위에 가열 패드에 배치했다. 물 수영 객관 렌즈는 라이브 에피 형광 관찰하기 위해 이용되었다. 우리는 머큐리 램프의 형광 불빛 아래에서 혈관의 PKH26 스테인드 RBC 흐르는 내부를 관찰했다. 우리가 그들의 RBCs 흐름 방향과 구조에 의해 기본 arterioles, 보조 arterioles, 모세 혈관과 정맥을 확인.
  2. 강화 SIT 카메라 (하마 마츠 Photonics, C240​​0, 일본)와 비디오 프레임 그래버는 실시간 비디오 속도 (초당 30 프레임)에서 낮은 강도의 신호를 캡처하기 위해 설치되었다. 이미지가 비디오 파일로 DVD에 기록되었다.

근육 자극

  1. 전기 펄스는 주변 신경 자극기 (Innervator 252, 피셔 & 페이켈 건강, 뉴질랜드)을 사용하여 생성하고, 코팅 스테인레스 프로브를 통해 근육의 표면에 전달했다. 마이너스 프로브 끝을 근육의 근위 부분에 배치되었고 플러스 끝을 근육의 말초 부분에 배치되었습니다. 파상풍 stimulations은 5 초 동안 50Hz의 속도로 제공되었습니다. 전기 자극은 접촉 영역의 주변에 직접 myofiber 손상을 일으키지 않았다.

RBC 플럭스 분석

  1. 기록 DVD 비디오 이미지는 프레임 그래버 소프트웨어 (비디오 사반트, 미국)를 통해 비디오 사반트 이미지 파일을 전송했다. 비디오 이미지는 각각의 스테인드 RBC을 시각화하기 위해 조정 속도가 검토되었다. RBC 플럭스은 분당 초점을 기본 arteriole 날아 RBC를 계산하여 측정되었다.

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Discussion

중요 techinical 포인트는 다음과 같다 : (1) 관찰을위한 생리 동물의 상태 (perfusative 솔루션, 체온의 환기, 산도), 스테인드 RBC (2) 사출 볼륨, 그리고 (3) 조건의 유지 보수 (최적 렌즈 선택, 형광 강도). 향후 응용 프로그램은 다음과 같습니다 pharmacophysiological 및 / 또는 분자 생물 학적 개입과 (A) 조합, arterio / arteriolo - 경화증과 neovascularization의 (B) 장기 관찰.

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Disclosures

동물 실험에 관한 모든 절차는 매사 추세츠 종합 병원의 연구 애니멀 케어에있는 분과의 검토와 승인되었습니다.

Acknowledgements

우리는 근육의 생체내 관찰에 그의 조언 JW Lichtman 감사합니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PKH26 dye Sigma-Aldrich 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice Animal Three to six month old males
pentobarbital anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).

Comments

1 Comment

  1. How do you adjust for overloading of the circulation since you are increasing the total blood volume of the mouse which I guess would have non-physiological implications?

    Reply
    Posted by: Moji M.
    November 26, 2009 - 12:18 PM

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