モスキート子育てのためのプロトコル(A. gambiae)

Biology

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Summary

このビデオでは、実験室で背面ハマダラカに使用される一般的なテクニックを示しています。実験室での蚊の世話をするための方法は、吸血性の成人に蛹に幼虫から生物のライフサイクルの全段階を経て実証されています。

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Das, S., Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e221, doi:10.3791/221 (2007).

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Abstract

このプロトコルは、昆虫館での蚊の飼育について説明します。昆虫館のお部屋は12時間で、℃、〜80%湿度28で保持されます。昼/夜サイクル。この手順では、蚊のケージ10%滅菌ショ糖溶液、ペーパータオル、ビーカー、ワットマン濾紙、ガラスフィーダー、ヒトの血液や血清、水浴、パラフィルム、蒸留水、きれいなプラスチックトレイ、蚊の食べ物を(説明​​する必要があります以下)、成人を収集するトレー、真空、及び収集チャンバーをカバーするために蚊帳。

Protocol

モスキート食べ物:

  1. 食べ物:接地された魚の餌(Aquaricare)。小さいピンチを追加する必要があります。
  2. 食べ物B:接地CATフード(ピュリナ)。小さいピンチを追加する必要があります。
  3. 食品C:猫フード(ピュリナ)。 2錠を追加する必要があります。

ブラッド:

動物またはヒトの血液は、背面蚊に使用することができます。新鮮な血液が注射器で採取し、血液の各10 mlのCPD(抗凝固)の1mlを含む滅菌15ミリリットルファルコンチューブに入れ、その後穏やかに混合し、5分間2000rpmで、室温で遠心分離する。上清を他の血液細胞(例えばWBC)を含むバフィーコートを除去するために世話をして、破棄されます。 RBCペレットをピペッティングによりRPMI培地の等量に懸濁し、そしてさらにこの培地で3回洗浄する。最終洗浄後、ペレット化赤血球はRPMI培地の等量に再懸濁させ、4℃(8-10日間保持することができます)で保存。ちょうど授乳する前に、RBCは(RPMIで)セルダウンペレットに(5分間2000rpmで)遠心分離され、パックされたRBCは40%のヘマトクリットを取得するために血清(O +ヒト血清)中に再懸濁されている。血液を37℃で常に送りのために保持されている必要があります。

1日目:

  1. 3〜5日齢成体メスの蚊が卵を産むために血を供給されています。
  2. 吸血のために、人工膜(パラフィルム)給電方式は、以下のように使用されます。

    1. 赤血球は(血液の準備については上記を参照)〜40%のヘマトクリット(パックされたRBC 40〜60%の血清)を取得するために血清不活化熱と混合されています。これは、ガラスのフィーダに追加されます。
    2. フィーダは、暖かい水ジャケット(37℃)に接続され、膜表面への蚊のアクセスを許可するようにケージに配置されます。
    3. 蚊が〜30分間供給することが許可されています。

3日目:

  1. 女性は二日、彼らが血を餌後に卵を産むでしょう。円錐形に包まれた小さなろ紙は、ろ紙​​が湿った得ることを確認して、蒸留水を含む小さなビーカーに入れられます。ビーカーは、産卵のた​​めに蚊の一晩ケージの内部に保持されます。

4日目:

  1. 蚊の卵を含む濾紙〜300 mlの蒸留水をプラスチックトレイに配置されます。食品のピンチをトレイに追加され、卵は、次の日の間に幼虫に孵化するために許可されています。

デイズ5 - 8:

  1. 成長する幼虫は食品Cの2つの錠剤で毎日供給し、密度と人口のために監視されます。八日目(5日齢幼虫)で、幼虫の人口は、各トレイ内の食品の食品Cのと2つの錠剤をのピンチで、1トレーから〜10トレーに希釈される。 (〜30分)

DAYS 9〜12:

  1. 幼虫は12日目(9日齢幼虫)の食品Cに毎日供給され、水は新鮮な水で変更されており、食品は(食品Bと食物Cの2つの錠剤のピンチ)が追加されます。蛹はこの段階で開発を開始します。トレイは、大人のエスケープを避けるために、ネットで覆われている。 (〜80〜10分)

13日目 - 15:

3日間 - サナギは、次の2の成人に現れるが許可されています。食品は、慎重に大人のエスケープを避けるためにネットを除去することによって幼虫/蛹に毎日与えられます。

16日目:

  1. 大人の真空に接続して吸引器を介してケージに収集されます。ケージには、10%ショ糖(オートクレーブ)やケージの処理中に発生する可能性のある潜在的な砂糖の流出を浸して底部にペーパータオルのライニングに浸したさ綿の芯を持つ小さな100mlのボトルで構成されています。 (〜30〜40分)

17日目 - 21:

  1. 大人(男性と女性の両方)、彼らは次のサイクルを開始するために再び血液に供給される前に、10%ショ糖を与えた、4-5日のための昆虫館室に保管されています。同じ蚊が複数回産卵するために使用することができます。
  2. 実験や飼育に必要されていない蚊は、冷凍庫にケージを置くことによって殺すことができます。使用されるトレーやケージは、それらが再び使用する前に洗浄し、乾燥する必要があります。

:蚊飼育法と異なるラボで多少のバラツキができる各種の方法があるかもしれません。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Food A Aquaricare Grounded fish food. A small pinch needs to be added.
Food B Purina Grounded cat food. A small pinch needs to be added.
Food C Purina Cat food. Two tablets needs to be added
RBC prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum
RPMI Medium
CPD anticoagulant
serum O+ human serum
Mosquito feeder
parafilm
Anopheles gambiae mosquitos
10% sucrose mosquito food
insectary

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References

  1. Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
  2. Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
  3. Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
  4. Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
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  7. Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30, (4), 49 (2005).
  8. Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).

Comments

10 Comments

  1. For your information, there are four larval instars/stages not three as mentioned in the section Late Stage Larvae.

    An alternative to collecting adult mosquitŒs by sucking is to pick the pupae into a cup with water and place the cup in the adult cage. This dŒs not require an advanced apparatus or the work of mouth aspirating. Also, there is no risk of the pupae escaping as with adults. The disadvantage of picking pupae is that it has to be done on a daily basis, but with good planning of the feeding it is possible to avoid picking the main bulk of the pupae on weekends.Olle Terenius, University of California, Irvine, USA

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2008 - 3:46 PM
  2. My name' Dui, I work in Institude of Malariology. Parasitology and Entomology in Ho Chi Minh city. I'm responsible for insectary. I feed mosquitŒs by alive mouse. Now I want to feed mosquitŒs by membrane feeder. I follow your instruction in video clips but the mosquitŒs couldn't suck blood through the membrane. I don't know The reason why The mosquitŒs didn't have blood inside their body. Can you help me ?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 29, 2009 - 7:22 PM
  3. Hi, This is Suchismita from Johns Hopkins University. Membrane feeding usually works for many mosquito species, but there are several that somehow do not take blood by membrane-feeding-for example, several arabiensis species and many others. What is your mosquito species? Also, are you using fresh blood. We have noticed that sometimes blood older than 1 week are no good. Then which serum are you using, as all these citical steps help. I would also recommend that you starve your mosquitŒs for few hours (6-7) before you provide blood by membrane-feeding assays. These makes them really hungry and they go for blood. Also try to swithch off the light of that room, dark somehow initiates their feeding. I hope these tips help you. In case you have more questions, please send me an email at sudas@jhsph.edu, I will be happy to answer.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:30 PM
  4. Dear Das:

    Greetings. I am an entomology researcher based in Jakarta, Indonesia.
    Could you please provide information on where I could obtain apparatus glass membran feeding for mosquito?

    Thank you.

    Arik Farzeli, DVM
    Medical Entomology Department
    Naval Medical Research Unit ²
    Jakarta, Indonesia

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 8, 2009 - 12:14 AM
  5. Hi, thanks for your video guide it has been very useful but I would like to know are there anyways by which i can download or buy., since the link in my area is very very bad. It took me 4 hours to watch 10:²3 minutes of this clip. can you help?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2009 - 1:29 PM
  6. FYI: Our lab uses mosquitŒs to maintain the life cycle of filarial nematode Brugia malayi and to generate larval stages of these parasites for other research activities. For membrane feeding, we routinely use "casing" (used in sausage making) or skin from chicken legs as membranes. "Casings" cost only few dimes and can be bought at any major grocery store. Casing is easy to attach to the glass feeders. Aedes mosquitŒs feed well on blood through casings than parafilm and should be good for other blood sucking critters.

    Reply
    Posted by: RamKrishna R.
    July 24, 2009 - 2:55 PM
  7. Hi RamKrishna,
    The technique you use is very practical, could you please give me more details about this, how you build
    the system feeding with skin from chicken legs. In the University insectary need to implement another
    technique different of menbrana parafim, becouse use a large population of mosquitŒs about of 1000 mosquitŒs simultaneously. We are raising the species: Aedes aegypti and Anopheles darlingi.

    What are the cage dimensions you use and how many mosquitŒs are in it?.

    thanks for share your experiences with us.
    if you could write to my email would be great, iram_8586@hotmail.com
    Maribel :D

    Reply
    Posted by: Maribel T.
    May 1, 2013 - 7:54 PM
  8. I work at K-state and maintain a small colony of A. gambiae. The adult feed on a homemade membrane feeder. The last ² feedings 1/² of the adults died. I ordered fresh blood citrated horse blood, this did not help. Do you have any thoughts as to what could be going on? I maintained the colony for several years, now I am having problems.
    The next question, is how to you clean the larva rearing trays?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2010 - 12:21 PM
  9. thank you for your video guide,lot of thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 3:14 AM
  10. Hi everybody

    I am Carlos and I am working with Anopheles darlingi in an insectary in the Peruvian Amazon
    .
    I would live to have the video. I don´t look it in my computer.

    Greetings

    Reply
    Posted by: Carlos T.
    December 30, 2013 - 10:31 AM

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