Protocole pour l'élevage des moustiques (A. gambiae)

Biology

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Summary

Cette vidéo illustre les techniques générales utilisées pour l'arrière Anopheles gambiae dans le laboratoire. Les méthodes pour prendre soin de moustiques de laboratoire sont démontrées par tous les stades du cycle de vie de l'organisme à partir de larves en pupes au sang maternel adultes.

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Das, S., Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e221, doi:10.3791/221 (2007).

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Abstract

Ce protocole décrit l'élevage de moustiques dans l'insectarium. Les chambres insectarium sont maintenus à 28 ° C et ~ 80% d'humidité, avec un HR 12. cycle jour / nuit. Pour cette procédure, vous aurez besoin de cages de moustiques, 10% d'une solution de saccharose stérile, des serviettes en papier, bécher, papier-filtre Whatman, les mangeoires de verre, le sang humain et le sérum bain d'eau, parafilm, eau distillée, nettoyer des bacs en plastique, de la nourriture contre les moustiques (décrit ci-dessous), déduction faite de couvrir les plateaux, vide, et une chambre de collecte pour recueillir moustiques adultes.

Protocol

Alimentaires des moustiques:

  1. Alimentation A: la nourriture des poissons à la terre (Aquaricare). Une petite pincée doit être ajouté.
  2. Alimentation B: mise à la terre la nourriture CAT (Purina). Une petite pincée doit être ajouté.
  3. Alimentation C: aliments pour chats (Purina). Deux comprimés doit être ajouté.

Sang:

Sang animal ou humain peut être utilisé pour les moustiques à l'arrière. Le sang frais est recueilli avec une seringue et mettre dans un tube stérile de 15 ml contenant 1 ml de Falcon DPC (anticoagulant) pour chaque 10 ml de sang, puis mélangés doucement et centrifugé à température ambiante à 2000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est écarté, en prenant soin d'enlever la couche leuco qui comprend d'autres cellules sanguines (par exemple WBC). Le culot de RBC est ensuite suspendu dans un volume égal de milieu RPMI par pipetage, et encore lavé dans ce trois moyennes fois. Après le lavage final, les globules rouges granulés sont remis en suspension dans un volume égal de milieu RPMI et conservés à 4 ° C (peut être conservé pendant 8-10 jours). Juste avant l'alimentation, la RBC (dans RPMI) est centrifugé (2000 rpm pendant 5 min) pour obtenir un culot en bas des cellules, et la RBC emballé est remis en suspension dans le sérum (O + sérum humain) afin d'obtenir un hématocrite de 40%. Le sang doit être conservé à 37 ° C toujours à l'alimentation.

JOUR 1:

  1. Les 3-5 jours moustiques adultes âgés féminins sont nourris de sang pour pondre leurs œufs.
  2. Pour nourrir le sang, une méthode de membrane artificielle alimentation (parafilm) est utilisé comme suit:

    1. Les globules rouges (voir ci-dessus pour la préparation du sang) sont mélangés avec du sérum inactivé par la chaleur pour obtenir un hématocrite ~ 40% (emballé RBC 40% et 60% de sérum). Ceci est ajouté à l'alimentation en verre.
    2. Le chargeur est relié à une chaude enveloppe d'eau (37 ° C), et placée sur la cage pour permettre l'accès des moustiques à la surface membranaire.
    3. Les moustiques sont autorisés à nourrir pour ~ 30 minutes.

JOUR 3:

  1. Les femelles pondent des œufs deux jours après ils se nourrissent de sang. Un petit papier filtre enveloppé dans une forme conique est placé dans un petit bécher contenant de l'eau distillée, en s'assurant que le papier filtre est humide. Le bécher est gardé à l'intérieur de la cage durant la nuit pour les moustiques de pondre des œufs.

JOUR 4:

  1. Le papier filtre contenant les œufs des moustiques est placé dans un bac en plastique avec environ 300 ml d'eau distillée. Une pincée de nourriture A est ajoutée à la barre et les oeufs sont autorisés à éclore au cours de larves les prochains jours.

JOURS 5 - 8:

  1. Larves en croissance sont nourris chaque jour avec deux comprimés de nourriture C, et surveillés pour la densité et la population. Le huitième jour (5 jours larves âgées), la population des larves est dilué de 1 Bac à ~ 10 plateaux, avec une pincée de nourriture A et deux comprimés de C des aliments dans chaque bac. (~ 30 minutes)

JOURS 9 - 12:

  1. Les larves sont nourries chaque jour avec de la nourriture C. Sur le 12ème jour (9 jours larves âgées), l'eau est changée avec de l'eau fraîche, et la nourriture est ajoutée (une pincée de nourriture B et deux comprimés de nourriture C). Les nymphes commence à se développer à ce stade. Les plateaux sont couverts de filets pour éviter de sortir des adultes. (~ 80 à 10 mn)

JOUR 13 - 15:

Les nymphes sont autorisés à émerger aux adultes pour les 2 prochains - 3 jours. La nourriture est donnée tous les jours pour les larves / nymphes par enlevant soigneusement le net pour éviter l'échappement des adultes.

JOUR 16:

  1. Les adultes sont recueillis dans une cage à travers un aspirateur relié à vide. La cage se compose d'un petit flacon de 100 ml avec une mèche de coton qui a été trempé avec du saccharose à 10% (autoclave) et une doublure serviette en papier sur le fond pour absorber les déversements potentiels de sucre qui peut se produire pendant la manipulation cage. (~ 30-40 minutes)

JOUR 17 - 21:

  1. Les adultes (mâles et femelles) sont ensuite conservés dans la salle insectarium pour les 4-5 jours, nourri de 10% de saccharose avant qu'ils ne soient à nouveau du sang nourris pour commencer le cycle suivant. Les moustiques mêmes peuvent être utilisées pour pondre plus d'une fois.
  2. Les moustiques qui ne sont pas nécessaires pour des expériences ou de l'élevage peuvent être tués en plaçant la cage dans un congélateur. Les plateaux utilisés et les cages doivent être nettoyés et séchés avant qu'ils puissent être utilisés à nouveau.

REMARQUE: Il peut y avoir quelques variations dans la méthode d'élevage des moustiques et des laboratoires différents peuvent avoir différentes techniques.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Food A Aquaricare Grounded fish food. A small pinch needs to be added.
Food B Purina Grounded cat food. A small pinch needs to be added.
Food C Purina Cat food. Two tablets needs to be added
RBC prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum
RPMI Medium
CPD anticoagulant
serum O+ human serum
Mosquito feeder
parafilm
Anopheles gambiae mosquitos
10% sucrose mosquito food
insectary

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
  2. Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
  3. Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
  4. Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
  5. Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
  6. Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
  7. Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30, (4), 49 (2005).
  8. Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).

Comments

10 Comments

  1. For your information, there are four larval instars/stages not three as mentioned in the section Late Stage Larvae.

    An alternative to collecting adult mosquitŒs by sucking is to pick the pupae into a cup with water and place the cup in the adult cage. This dŒs not require an advanced apparatus or the work of mouth aspirating. Also, there is no risk of the pupae escaping as with adults. The disadvantage of picking pupae is that it has to be done on a daily basis, but with good planning of the feeding it is possible to avoid picking the main bulk of the pupae on weekends.Olle Terenius, University of California, Irvine, USA

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2008 - 3:46 PM
  2. My name' Dui, I work in Institude of Malariology. Parasitology and Entomology in Ho Chi Minh city. I'm responsible for insectary. I feed mosquitŒs by alive mouse. Now I want to feed mosquitŒs by membrane feeder. I follow your instruction in video clips but the mosquitŒs couldn't suck blood through the membrane. I don't know The reason why The mosquitŒs didn't have blood inside their body. Can you help me ?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 29, 2009 - 7:22 PM
  3. Hi, This is Suchismita from Johns Hopkins University. Membrane feeding usually works for many mosquito species, but there are several that somehow do not take blood by membrane-feeding-for example, several arabiensis species and many others. What is your mosquito species? Also, are you using fresh blood. We have noticed that sometimes blood older than 1 week are no good. Then which serum are you using, as all these citical steps help. I would also recommend that you starve your mosquitŒs for few hours (6-7) before you provide blood by membrane-feeding assays. These makes them really hungry and they go for blood. Also try to swithch off the light of that room, dark somehow initiates their feeding. I hope these tips help you. In case you have more questions, please send me an email at sudas@jhsph.edu, I will be happy to answer.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:30 PM
  4. Dear Das:

    Greetings. I am an entomology researcher based in Jakarta, Indonesia.
    Could you please provide information on where I could obtain apparatus glass membran feeding for mosquito?

    Thank you.

    Arik Farzeli, DVM
    Medical Entomology Department
    Naval Medical Research Unit ²
    Jakarta, Indonesia

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 8, 2009 - 12:14 AM
  5. Hi, thanks for your video guide it has been very useful but I would like to know are there anyways by which i can download or buy., since the link in my area is very very bad. It took me 4 hours to watch 10:²3 minutes of this clip. can you help?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2009 - 1:29 PM
  6. FYI: Our lab uses mosquitŒs to maintain the life cycle of filarial nematode Brugia malayi and to generate larval stages of these parasites for other research activities. For membrane feeding, we routinely use "casing" (used in sausage making) or skin from chicken legs as membranes. "Casings" cost only few dimes and can be bought at any major grocery store. Casing is easy to attach to the glass feeders. Aedes mosquitŒs feed well on blood through casings than parafilm and should be good for other blood sucking critters.

    Reply
    Posted by: RamKrishna R.
    July 24, 2009 - 2:55 PM
  7. Hi RamKrishna,
    The technique you use is very practical, could you please give me more details about this, how you build
    the system feeding with skin from chicken legs. In the University insectary need to implement another
    technique different of menbrana parafim, becouse use a large population of mosquitŒs about of 1000 mosquitŒs simultaneously. We are raising the species: Aedes aegypti and Anopheles darlingi.

    What are the cage dimensions you use and how many mosquitŒs are in it?.

    thanks for share your experiences with us.
    if you could write to my email would be great, iram_8586@hotmail.com
    Maribel :D

    Reply
    Posted by: Maribel T.
    May 1, 2013 - 7:54 PM
  8. I work at K-state and maintain a small colony of A. gambiae. The adult feed on a homemade membrane feeder. The last ² feedings 1/² of the adults died. I ordered fresh blood citrated horse blood, this did not help. Do you have any thoughts as to what could be going on? I maintained the colony for several years, now I am having problems.
    The next question, is how to you clean the larva rearing trays?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2010 - 12:21 PM
  9. thank you for your video guide,lot of thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 3:14 AM
  10. Hi everybody

    I am Carlos and I am working with Anopheles darlingi in an insectary in the Peruvian Amazon
    .
    I would live to have the video. I don´t look it in my computer.

    Greetings

    Reply
    Posted by: Carlos T.
    December 30, 2013 - 10:31 AM

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