Author Produced

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Questo protocollo descrive un metodo non-virale di consegna di costrutti genetici per una certa area del cervello dei roditori viventi. Il metodo consiste di preparazione plasmide, fabbricazione micropipetta, chirurgia neonatale dei cuccioli di ratto, microiniezione del costrutto, e

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Creazione di animali transgenici è un approccio standard per studiare le funzioni di un gene di interesse in vivo. Tuttavia, molti knockout o animali transgenici non sono sostenibili a quei casi in cui viene espresso il gene modificato o cancellato in tutto l'organismo. Inoltre, una varietà di meccanismi di compenso spesso rendono difficile l'interpretazione dei risultati. Gli effetti di compensazione può essere alleviato con tempismo sia l'espressione genica o limitando la quantità di cellule transfettate.

Il metodo di postnatale non-ventricolare microiniezione e elettroporazione in vivo permette somministrazione mirata di geni, molecole di colorante siRNA o direttamente a una piccola regione di interesse nel cervello dei roditori neonato. In contrasto con tecnica convenzionale iniezione ventricolare, questo metodo permette di trasfezione di non-migratori tipi di cellule. Animali trasfettate mediante il metodo descritto qui può essere utilizzato, ad esempio, per i due fotoni imaging in vivo o in esperimenti elettrofisiologici su sezioni di cervello acuto.

Protocol

1. Introduzione

Creazione di animali transgenici è un potente metodo di indagine delle funzioni dei geni in animali vivi 1 e per il meccanismo di svelare la malattia 2,3 così come per manipolare le proprietà delle cellule 4. Tuttavia, la procedura è piuttosto laboriosa, estremamente lunga e costosa, così da giustificare l'uso di metodi alternativi consegna del gene virale come l'iniezione 5, iniezione ventricolare neonatale con elettroporazione 6 e in utero elettroporazione 7,8. Il metodo di postnatale non-ventricolare di iniezione ed elettroporazione è un insieme unico di vantaggi: uso di costrutti genetici non virali; possibilità di creare un modello di espressione locale della zona di interesse; in situ di transfezione non migratorie tipi di cellule, ad esempio corticale astrociti.

In questo video, dimostriamo la procedura dettagliata di consegna del gene postnatale al cervello di ratto neonatale utilizzando un plasmide codifica per la proteina fluorescente verde potenziato da un promotore di pollo beta actina con CMV enhancer (pCAG-EGFP) 9. Illustriamo la preparazione del plasmide contenente soluzione iniettabile, la produzione di pipette di vetro sottile e montaggio delle microinjector su uno strumento stereotassico. Poi si parla di anestetizzante ratti con isoflurano, circa l'effettuazione dell'intervento, in merito alla procedura di iniezione e sulla elettroporazione utilizzando elettrodi forcipe e in porator vivo. Infine, abbiamo brevemente i risultati attesi, le prospettive e le difficoltà che possono sorgere durante questi esperimenti.

2. Preparazione plasmide per elettroporazione

  1. Noi di solito preparare 10 ml di soluzione per l'iniezione plasmide in un tubo di 200 l parete sottile. Questa soluzione è sufficiente per alcuni esperimenti.
  2. Noi mix 8 microlitri della soluzione del plasmide (vedi Materiali e attrezzature) con 1 microlitri della PBS 10X (vedi Materiali e attrezzature) e 1 ml di soluzione allo 0,1% Veloce acqua verde (vedi Materiali e attrezzature).
  3. La concentrazione finale del plasmide nella soluzione iniettabile deve essere compreso tra 1 e 3 mg / mL. Concentrazioni più basse di DNA plasmidico riduce l'efficienza di transfezione, mentre la più alta concentrazione di DNA sarà troppo viscoso per l'iniezione attraverso la punta sottile del vetro capillare.

3. Vetro Ago Preparazione

  1. Per la preparazione pipetta di vetro, si usa vetro borosilicato capillare con un filamento (vedi Materiali e attrezzature) e una verticale estrattore elettrodo di vetro (vedi Materiali e attrezzature) per la massima trazione e riscaldamento parametri.
  2. Abbiamo poi rompere la punta della pipetta con un pezzo di carta per ottenere una punta di 10-20 micron di diametro.
  3. Controlliamo il diametro punta e forma sotto l'obiettivo microscopio.

4. Microinjector Assemblaggio

  1. Usando un sottile polimero capillare (vedi Materiali e attrezzature) abbiamo riempire circa 1 / 3 del volume di un 10 microlitri Hamilton siringa (vedere Materiali e attrezzature) con olio minerale (vedi Materiali e attrezzature). Evitare bolle d'aria!
  2. Poi abbiamo riempire la pipetta di vetro con olio minerale e inserire la pipetta nella siringa Hamilton. Evitare bolle d'aria!
  3. La siringa di vetro con pipetta viene poi fissata sul microinjector collegati a un controller (vedi Materiali e attrezzature).
  4. Il setup microiniezione fisso su uno strumento stereotassico (vedi Materiali e attrezzature) ci permette di immergere in tutta sicurezza la punta della pipetta di vetro nella provetta con la soluzione di iniezione plasmide.
  5. Quando la punta tocca la superficie della soluzione, immergetelo millimetri ulteriormente da 1 o 2 e riempire la pipetta con circa 1 ml della miscela di iniezione iniettore con il micro controller.

5. Animali anestetizzante

Tutte le procedure qui presentate sono state eseguite secondo l'Università di Helsinki regolamenti per gli esperimenti sugli animali.

  1. Per ogni esperimento, riempire una siringa a tenuta di gas (vedi Materiali e attrezzature) con circa 2 ml di isoflurano (vedi Materiali e attrezzature).
  2. Che la siringa è fissato sull'unità anestesia (vedi Materiali e attrezzature) collegato alla sorgente del flusso d'aria, la finestra di animali e la maschera fissa sulla configurazione stereotassica.
  3. Sull'unità anestesia, correggiamo il flusso d'aria a circa 250 ml / min e il livello di isoflurano al 4%.
  4. Abbiamo posto il topo cucciolo nella casella di animali per 2-5 minuti.
  5. Quando il cucciolo smette di muoversi, posto sulla rampa di riscaldamento (vedi Materiali e attrezzature) collegato alla configurazione stereotassica.
  6. Inserire una parte rostrale del cucciolo la testa nella maschera anestetizzante.
  7. Ci vogliono 5 a 10 minuti per ilcucciolo di entrare nel anestesia profonda.
  8. Controllare profondità dell'anestesia con un pizzico di coda e diminuire l'afflusso isoflurano a circa 1,5 al 2,0%.

6. Chirurgia, microiniezione e Elettroporazione

  1. Trattare la pelle del cucciolo testa con l'etanolo al 70%.
  2. Utilizzando piccole forbici (vedi Materiali e attrezzature) e pinze sottili (vedi Materiali e attrezzature), tagliare la pelle da un collottola del cucciolo alla sua fronte.
  3. Piegare pezzi pelle lateralmente e tirare le barre orecchio leggermente in orifizi sonora del cranio per la testa e la fissazione della pelle.
  4. Utilizzando un microscopio binoculare, abbiamo individuare il punto bregma sul cranio.
  5. Identificare la regione di interesse utilizzando le coordinate stereotassica.
  6. Posizionare la pipetta di iniezione di sopra di questa regione e contrassegnarlo facendo cadere 25-50 nl della soluzione iniettabile sulla superficie del cranio.
  7. Forare il cranio con delicatezza e attenzione nel punto segnato con un trapano ad alta velocità chirurgico (vedi Materiali e attrezzature) al microscopio fino liquido appare nell'area forato.
  8. Fissa un elettrodi electropotation pinza (vedi Materiali e attrezzature) ai lati del cranio con gel conduttore di corrente (vedi Materiali e attrezzature) per ottenere una migliore conduttività.
  9. Rimuovere la goccia di liquido dal foro con tampone di piccole dimensioni (vedi Materiali e attrezzature) e immergere l'ago di vetro al foro secondo le coordinate del sito di iniezione.
  10. Infondere 25-100 nl della soluzione iniettabile al tasso da 5 a 20 nl / sec.
  11. Rimuovere rapidamente la pipetta e electroporate immediatamente. Elettroporazione viene effettuata mediante l'applicazione di cinque impulsi rettangolo con la durata di 50 ms e l'ampiezza di 99 V alla frequenza di 1 Hz.
  12. Rimuovere gli elettrodi e bar orecchio.
  13. Cucire la pelle tagliata usando una combinazione di una pinza muto (vedi Materiali e attrezzature) e taglienti e fili chirurgici (vedi Materiali e attrezzature).
  14. Collocare il cucciolo nella camera calda per 15-30 minuti per aiutare il suo recupero dopo l'anestesia.
  15. Poi mettere il cucciolo torna alla gabbia della madre.

7. Rappresentante Risultati

L'espressione del transgene nelle cellule transfettate con successo apparirà circa 10 ore dopo l'elettroporazione, e rimarrà stabile per diverse settimane.

Noi microiniettati il plasmide sia in profondità strati corticali o regione striato del giorno post-natale 2 (P2) e cuccioli di ratto Wistar eseguita in elettroporazione in vivo come descritto sopra. Sezioni di cervello (400 micron di spessore) sono stati tagliati dopo 2 a 6 giorni (P4-P8) usando un vibrotome a freddo affettare a pezzi medi (Hepes tamponata soluzione equilibrata Salt Earle) 10. Acquisizione delle immagini è stata effettuata utilizzando Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal microscopio confocale (Zeiss, Germania) nel medio taglio a temperatura ambiente.

I siti di iniezione in profondità strati corticali e nello striato contenute molte cellule transfettate che esprimono EGFP che si trovavano in una regione compatta di circa 200-300 micron di diametro (Figura 1A, B). All'interno delle cellule transfettate, il livello di espressione EGFP è sufficientemente elevato per consentire l'imaging di sottili processi cellulari (Figura 1C) tra cui dendriti con spine di forme diverse (Figura 1D) e fasci di assoni (Fig. 1E). La stabilità robusta di EGFP così come la vitalità cellulare dopo l'elettroporazione permesso tracciamento parti distali degli assoni (fino a 1,5-2 mm dal corpo cellulare), come terminali corticali (Figura 1F).

Figura 1
Figura 1. (A) transfettate con successo le cellule nella regione striato di cervello di ratto P4 delineare il plasmide sito di iniezione. (B), le cellule transfettati in profondità strati corticali (circa 1000 micron sotto la superficie corticale) di cervello di ratto P5. (C) Una cellula trasfettate nella regione striato di ratto cervello P8. (D) i processi di una cellula dendritiche transfettate nella regione striato di ratto cervello P8; frecce indicano i diversi tipi di spine dendritiche e filopodia. (E) Gli assoni delle cellule transfettate in via collaterale. (F) Gli assoni che terminano presso l'superficie piale di P8 ratto corteccia (punta di freccia). Barre di scala sono 100 micron su A, B, E e F; 10 micron su C e D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodi di consegna del gene nel cervello dei roditori viventi sono ben stabiliti per elettroporazione in utero 7,8,11,12 e, più recentemente, per l'elettroporazione postnatale 6. Tuttavia, questi metodi si basano su iniezione intraventricolare del DNA plasmide, che può essere limitante per diverse applicazioni. Per esempio, questi metodi non consentono targeting cellule in alcune aree cerebrali quali l'ippocampo, né la transfezione di questi non-migratori tipi di cellule come astrociti corticali. Non-ventricolare iniezione accoppiato con elettroporazione è stato impiegato per la consegna del gene nei neuroni del cervelletto 13. Il nostro protocollo illustra l'estensione della non-ventricolare metodo per altre regioni del cervello di ratto. Proponiamo che il nostro approccio metodologico è una valida alternativa ai metodi di consegna del gene virale alle aree riservate di interesse all'interno del cervello di ratto post-natale 5.

Nonostante i vantaggi del metodo attuale, alcune difficoltà ci si può aspettare come descritto di seguito.

Età 1.Optimal di animali

Quando possibile, più giovane cuccioli di ratto neonato dovrebbe essere utilizzato, come mezzo per incrementare sia l'efficacia di trasfezione e della sopravvivenza dei cuccioli dopo l'intervento chirurgico. Nelle nostre mani, il P0 cuccioli sono troppo piccoli in quanto è difficile obiettivo riproducibile una certa area del cervello utilizzando stereotassica coordinate ottenute dal cervello atlante disponibili per questo all'età di 14 anni. Inoltre, il P0 cuccioli hanno la pelle sottile e tenera che possono impedire cucire. Il P3 e P4 sono più conveniente in termini di manipolazioni chirurgiche e stereotassica, rispetto a P0-P2 animali, ma hanno ipersensibilità al anestesia isoflurano che possono causare convulsioni e interruzioni di respirazione durante l'intervento. Così, la migliore opzione è P1-P2 cuccioli di ratto, che sono prevedibili durante l'intervento chirurgico e abbastanza grande per microiniezioni riproducibile.

Problemi 2.Possible con microiniezione

Quando piccoli volumi di soluzione (25-100 nl) sono iniettati attraverso punta di vetro sottile al tessuto cerebrale esercita una pressione avversaria, è fondamentale che le bolle d'aria o perdite sono accuratamente evitati. Il mancato rispetto di questi può causare una diminuzione drammatica in termini di efficienza di trasfezione.

3.Precision limiti per le coordinate stereotassiche

Nonostante la precisione delle coordinate stereotassiche, hanno un limite a 0,3 riproducibilità mm 15. Nella nostra esperienza l'uso di animali della stessa età e il peso è possibile ridurre questo limite di 0,2-0,1 mm che è sufficiente per il targeting riproducibile dell'area CA1 dell'ippocampo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Ringraziamo Ekaterina Karelina per un aiuto con la registrazione colonna sonora per il video, Ivan Molotkov di animazione 3D e il Dr. Peter Blaesse per CAG-EGFP preparazione plasmide.

Il lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del Centro di Mobilità Internazionale della Finlandia, il finlandese della Fondazione Culturale e l'Accademia di Finlandia.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
  2. McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
  3. Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
  4. Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
  6. Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
  7. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  8. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
  10. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  11. Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  12. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  13. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
  14. Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. 3rd edition, Academic Press. (2008).
  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics