크레이 피쉬 Hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습

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Neuroscience
 

Summary

이 보고서에서 우리는 크레이 피쉬 hindgut의 생물을 조사하는 데 사용할 수있는 기법을 보여줍니다. 우리는 가재의 복부를 절개하다와 관련된 해부학, 생리학 활동의 변조를 연구하는 방법을 보여줍니다. 수축의 연동 활동과 강도는 강제 변환기를 사용하여 측정하고 있습니다.

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Cooper, A. S., Leksrisawat, B., Gilberts, A. B., Mercier, A. J., Cooper, R. L. Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise. J. Vis. Exp. (47), e2324, doi:10.3791/2324 (2011).

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Abstract

보고서의 목적은 크레이 피쉬 hindgut 준비를위한 해부 기술을 설명하고 수축의 강도를 모니터하는 힘 변환기와 생리 녹음을하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 또한, 우리는 시각적으로 다양한 펩티드, biogenic 아민과 신경 전달 물질의 bioassay로 사용할 수있는 연동 활동을 모니터하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 생리학과 학생들에게 약리 개념을 보여주는 학생의 실험실 의무가 있습니다. 이 준비는 100 년 이상 사용되고 있으며, 그것은 여전히​​ 연동 리듬의 생성 및 규정을 조사 및 자신의 변조를 기본 메커니즘을 설명하기위한 모델로 많이 제공합니다. 약리 assays과 수용체 hindgut에 50 년 전에 시작되었다 서브 타이핑은 오늘날에도 연구에 기여하고 있습니다. 이 강력한 준비가 잘 생리학과 약리학의 교육 학생들에게 적합합니다.

Protocol

1. 소개

크레이 피쉬 hindgut의 가장 최근의 포괄적인 개요는 serotonergic 변조 및 innervation (Musolf 외., 2009 주로 초점을 맞추고 박사 바바라 E. Musolf (2007 년, 조지아 주립 대학, 애틀랜타, 조지아, 미국)에 의해 논문으로 준수되었다 ). 갑각류의 hindguts 먼저 Alexandrowicz들이 innervation의 다양한 측면을 설명하는 비교 해부학의 선구자 (Alexandrowicz, 1909)에 의해 100여 년 전에 공부했다. 연구는 전체 동물 osmoregulation에 hindgut의 전반적인 기능을 해결하고, (Musolf, 2007 리뷰를 참조) 여러 화합물에 의해 hindgut 수축성의 modulatory 제어를 검토, 근육의 레이어와 건축의 유형을 식별, 년간 계속했다. 그것은 hindgut의 항문 부분이 대변을 추방하기 위해뿐만 아니라 osmoregulation을위한 환경에서 물을 갈뿐만 아니라 행위 점에 유의하는 흥미롭습니다. 창자의이 지역은 앞으로 받아야이나 동물의 필요에 따라 연동을 반대 수 있습니다.

Alexandrowicz (1909)은 갑각류 hindgut, 내부 신경 얼기 나중에 신경 전달 물질을 식별하고 특성화에 대한 풍부한 소스 것으로 판명 외부 신경 얼기를 innervating이 신경 plexuses 확인. 1950 년대 박사 에른스트 플로리에서 크레이 피쉬 hindgut에 대한 약리 연구 시리즈를 시작하고 수축은 아세틸콜린 및 관련 화합물에 의해 또한 에피네프린과 norepinephrine (플로리 1954)에 의해 변조된 것을 보여주었다. 플로리로 알려진 억제 물질의 발견자 "팩터 - I은"왕새우의 GI 시스템 (플로리, 1961) 등 다양한 준비,이 물질의 효과를 공부했습니다. 팩터 - 내가 나중에 GABA로 표시되었다. 따라서, 왕새우 hindgut은 시냅스 억제의 초기 연구에 중요한 역할을했습니다.

GABA의 발견에 따라 다른 putative 송신기도 hindgut의 plexuses와 관련된 것으로 표시되었으며 생리 반응을 이끌어내는 수 있습니다. 이 orcokinin의 펩티드를 (NFDEIDRSGFGFN 및 AFDEIDRSGFGFN; Bungart 외 1994;.. Dircksen 2000), (머시 1,997 RYLPG - 오.) proctolin, 이러한 트랜스 미터는 도파민 (. Elofsson 외 1968. Elekes 1988) 포함 , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen 외 2000.) 및 myosuppressin의 펩타이드 (머시 외 1997;... 대부분 pQDLDHVFLRFamide, CF Stemmler 2007). 이러한 물질들은 각각 자연 hindgut의 수축을 modulates하고, GABA를 제외한 모든이 흥분성의 것으로 나타납니다. hindgut는 글루 탐 산염과 quisqualate (. 존스, 1962; 2,003 롱)에 대응하지만, glutamatergic innervation에 대한 명확한 증거는보고되지 않았습니다. 다양한 송신기의 효과를 중재 세포내 메신저는 대부분 미개척지만, 수축 (Knotz & 머시, 1995)을 향상시키기 위해 도파민의 능력에 캠프의 참여에 대한 증거가 있습니다.

갑각류의 hindgut가 denervation 다음과 같은 자발적 계약 있지만, 이러한 수축은 일반적으로 연약하고 (; Winlow & 라베락, 1972a 웨일스, 1982) 비계 획 있습니다. 연동 운동은 분명히 지난 복부 신경절 (Winlow & 라베락, 1972a, B, C)에서 발생, 중추 신경 시스템에서 조정 모터 출력을 필요로합니다. 크레이 피쉬에서는, 모터 출력은 세포 기관은 지난 복부 신경절 (Kondoh & 히사다, 1986)에서 현지화된 아르 75 axons를 포함하는 7 복부 루트를 통해 hindgut으로 수행됩니다. 적어도 펩티드 중 일부는 지난 복부 신경절 (..; 머시 1991b; Dircksen 2,000 Siwicki & 비숍, 1986)에서 발생하는 뉴런에서 hindgut 신경 얼기에 공급되는 나타나지만 도파민이 더의 뉴런에 의해 제공됩니다 앞쪽에 신경 (머시 외. 1991a). 7 복부 루트를 통해 모터 출력이 큰 조정 수축에 필요한 있기 때문에, 그것은 위에 나열된 putative 송신기의 일부 또는 전체가 연동하는 어떤 방법으로 기여할 가능성이 높습니다. 그들의 상대적인 기여도 그러나, 알려져 있지 않습니다. 어떤 통찰력은 별도로 원형과 세로 근육 (머시 & 리, 2002) 그들의 효과를 연구하여 얻은 수 있습니다.

소화되지 않은 음식의 움직임을 제어뿐만 아니라, 갑각류 hindgut과 관련된 신경 얼기는 털갈이과 관련된 중요한 내분비 기능을 게임에 나타납니다. 게, Carcinus maenas의 hindgut 물의 이해에 역할을 제안하고 털갈이과 관련된 부종, 탈피 (웹스터 외. 2000) 중 갑각류의 hyperglycemic 호르몬 및 관련 전구체 펩타이드를 공개 내분비 세포가 포함되어 있습니다. 따라서, 갑각류 hindgut 몇 가지 중요한 생리 과정에 참여하고 있습니다.

이 보고서는 주로 고급 고등학교와 실험에 참가 생리 과정에 학부 학생들을위한 교육 도구입니다. 의미뿐만 아니라 hindgut 계약과 기능은 학생들이 해결될 수있는 방법을 뒤에 잠재적인 메커니즘. 약리 대리인, 신경 전달 물질, 그리고 neurohormones 사용되며, 투약 - 반응 곡선은 생리 및 약리 데이터를 수집하고 해석하는 방법에 학생들을 참여되는 건설 것입니다. agonists 및 antagonists에 관한 수용체 기능의 일반적인 이해도 형성될 수 있습니다. 학생들은 또한 통계 분석을 위해 그래픽 형태의 데이터를 제시 배우게됩니다.

크레이 피쉬 hindgut에서 수축을 해부하다하고 기록하는 것은 매우 쉽습니다. 해부 준비에 창자가 쉽게 외인성 물질에 노출됩니다. 연동 활동의 변경은 시각이나 또한 수축의 힘을 확인할 수 있습니다 힘 변환기와 모니터링할 수 있습니다. 때문에 bioassay 준비로서 단순하고 신뢰성, 크레이 피쉬 hindgut 아직도 연동, 모터 출력 및 근육 수축의 변조 및 수용체 기능의 메커니즘에 대해 많은 연구 질문 조사에 매우 유용합니다. hindgut는 행동의 구체적인 메커니즘에 대한 검사 살충제, crustaceancides 및 오염 물질에도 유용합니다.

2. 방법

2.1) 자료

  • 왕새우
  • 크레이 피쉬 살린
  • 절개 장비 (거친 & 고급 가위, 굵은 & 멋진 포셉)
  • Sylgard 바닥 페트리 접시
  • 스틸 해부 핀
  • 비커 (화학 솔루션을 개최)
  • parafilm (솔루션을 다루는 및 믹싱을위한)

2.2) 해부

  1. 신체 길이 크레이 피쉬 (Procambarus clarkii) 측정 6-10센티미터는 절개가 시작하기 전에 동물을 마취시킬 수 5-10분 위해 얼음에 배치해야합니다.
  2. 한손으로 발톱 뒤에서 anesthetized 왕새우를 잡아. 신속, 눈 소켓에서 양쪽 머리의 중간에 잘라 다음 왕새우 (참고 : 준비에서 혈액이 완료되었을 때 그것이 마르면 때문에 도구를 씻어 쓰는 것입니다)을 참수 형에 처하다.
    그림 1
    그림 1 : 왕새우 목베기
  3. chelipeds 걷는 다리를 잘라.
  4. 단지 중간 tailfin (uropod)를두고, 왼쪽과 오른쪽 tailfins를 잘라.
  5. 왕새우 등의 측면에있는 등 지느러미 표피의 왼쪽과 오른쪽 모두에 ventrally 했네요.
    그림 2
    그림 2 : 도설 표피 제거
  6. 상처가 다음 등의 복부 표피의 아래 부분을 제거 GI 손상을 방지하기 위해 얕은되어 있는지 확인하고, 표피의 지느러미 측면에 transversely 잘라.
  7. Sylgard 늘어선 요리로 해부 왕새우를 놓습니다.
  8. tailfin의 끝에 접시에 왕새우를 핀. 시체를 잡아 필요에 따라 하나는 GI의 양쪽에 대한 자세한 핀을 사용할 수 있습니다.
  9. GI 계속 피펫을 사용하여 호수로 GI 꺼 있는지 확인하십시오 커버 크레이 피쉬 호수와 함께 요리를 입력합니다. 5.3 MM KCl,, 13.5 MM CaCl 2 2 시간 2 O, 2.45 MM MgCl 2 6H 2 O, 호수가 205 MM NaCl로 만든 수정 반 Harreveld의 솔루션 (1936)입니다 5 MM의 HEPES 및 산도 7.4로 조정. 해부 크레이 피쉬는 그림 3과 같이 나타납니다.
    그림 3
    그림 3 : 손상 GI와 해부하는 왕새우.

2.3) 실험

동물의 2.3.1) 진통

  1. 준비 해수욕장 호수 같은 온도에서 테스트하는 화합물의 솔루션을합니다. 켜기 세로토닌의 개별 솔루션 (100 NM, 1microM), 글루 탐 산염 (1microM) 및 테스트되기 시작 물질로 크레이 피쉬 호수에서 만들어진 도파민 (1microM)을 사용할 수 있습니다.
  2. 10 분 정도에 대한 왕새우 솔루션에 앉아 해부 왕새우 그것이 해부 및 생리 노출의 충격을 조정할 수 있도록 허용합니다. hindgut에서 느린 연동의 수축이 발생하기 시작한다.
  3. 수축이 시작되면 30 초 (즉, 연동 유형, 또는 경련, 및 연동 파도의 방향 발생하는 수축의 종류를 참고)에서 발생하는 수축의 수를 기록합니다.
    표 1 : 크레이 살린에서 진통
    수축 번호 진통의 종류
  4. PI를 사용pette은 왕새우의 노출 복부의 캐비티 내에 호수를 제거하고, hindgut에 직접 검사하는 물질을 포함하는 호수를 적용합니다.
  5. 즉시 솔루션을 추가한 후 30 초 이후에 발생하는 수축의 수를 기록하고 (즉 연동, 또는 뇌성 마비 환자) 발생하는 수축의 종류를 확인합니다.
    표 2 : 화합물에 대한 노출과 진통
    컴파 운드 테스트 집중 수축 번호 진통의 종류
  6. 즉시 시험 물질에 대한 응답을 녹음 후 정상 크레이 피쉬 호수와 GI 여러 번 씻어. 크레이 피쉬 식염수에 30 초마다 약 rinsing 동안 준비가 5 분 동안 서 보자.
  7. 피펫을 사용하여 검사 또는 마지막으로 물질의 다양한 농도가 hindgut에 직접 테스트하기 위해 다음 화합물을 포함하는 식염수를 넣으십시오. 그것은 낮은 농도와 높은 농도하기 위해 노력하다의 방법으로 시작하는 것이 좋습니다.
  8. 바로 각각의 새로운 물질이나 새로운 각 농도를 삽입한 후 30 초 이후에 발생하는 수축의 수를 기록하고 수축의 종류를 확인합니다.

2.3.2) excised 준비에 수축의 기록 세력

그림 4
그림 4 : 설정

  1. 다리 포드에 변환기를 부착합니다.
  2. PowerLab 26T에 다리 포드를 연결합니다.
  3. 컴퓨터의 USB 포트에 PowerLab의 26T를 연결합니다.
  4. 바탕 화면에 labchart7 아이콘을 클릭하여 엽니다 LabChart7.
    • LabChart 웰컴 센터 상자가 열립니다 나타납니다. 그것을 닫습니다.
    • 설정을 클릭하십시오
    • 채널 설정을 클릭합니다. 확인을 누르면 1 (상자의 왼쪽 하단)에 채널 번호를 변경합니다.
    • 차트의 맨 왼쪽에 2K 약 초당 사이클로 설정합니다. 500 또는 200 뮤직 비디오에 볼트 (Y 축)을 설정합니다.
    • 차트의 오른쪽에 채널 1을 클릭합니다. 입력 앰프를 클릭하십시오. 않도록 설정 : AC 결합, 단일 종단, 그리고 반전 (필요한 경우 신호를 전도), 그리고 안티 - 별칭, 확인합니다.
    • 기록 프레스 시작를 시작합니다.
  5. 준비를 선택하고 흉부와 복부 사이의 시점에서 GI 트랙트를 잘라. 그런 다음 조심스럽게 꼬리 텔슨 부분 주위 컷. 해부 크레이 피쉬에서 GI 트랙트를 제거하고 Sylgard 요리에 넣습니다. GI 트랙트의 지느러미 부분을 따라 실행하는 혈관이 있습니다. 조심스럽게 GI 트랙트 멀리 이것을 가져옵니다. 준비에 신선한 크레이 피쉬 호수 붓고.
  6. 해부 크레이 피쉬 근처 클램프의 힘 변환기를 배치합니다.
  7. 그림 5에 표시된 왕새우 GI의 힘 변환기를 연결.
    그림 5
    그림 5 : 힘 변환기의 갈고리에 연결된 호수에서 왕새우 절연 hindgut
  8. LabChart7에서 시작 GI가 계약에 시작할 때까지 기다려, 그리고 밀고.
  9. 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. "오직 살린", "그만"와라는 코멘트를 추가하십시오. 푸시 표 4를 입력하십시오.
    표 4 : 관심의 화합물로 진통
    수축 번호 수축 진폭 (MV)
  10. 관심의 테스트 화합물을 추가하고, 즉시 LabChart7에서 "시작"푸시.
  11. 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. "중지"를 눌러 직접 차트 파일을 추가했던 물질과 그 농도로 코멘트를 추가하십시오. 아래의 테이블을 작성하십시오.
    표 5 : _________ 화합물과 진통
    수축 번호 수축 진폭 (MV)
  12. 피펫을 사용하여 크레이 피쉬 호수와 준비를 씻어 내 버리지.
  13. 비슷한 방법으로 다른 물질이나 여러 가지 농도를 추가합니다. 바로 LabChart7에서 "시작"푸시.
  14. 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. 푸시는 "중지"및 C를 나타내는 직접 차트 파일에 주석 및 레이블을 추가사용 농도 ompound.

3. 데이터 분석

  1. 실험 그래프 각 솔루션 (호수, 세로토닌, 글루 탐 산염) 대부터 수축의 수를 2.3.1에서. 어떤 경향을 설명합니다.
  2. 실험, 그래프의 각 솔루션의 수축의 수를 (호수, 세로토닌, 글루 탐 산염) 대 뮤직 비디오에서 수축의 진폭의 2.3.2에서. 어떤 경향을 설명합니다.

3.1) 수축의 속도와 힘을 측정

인덱스에 수축의 속도 한 편향의 처음부터 다음의 시작 시간을 측정하거나 분만을 통해 총 deflections을 계산합니다. 값은 다음 그들이 발생하는 방법에 따라 신속하게 분 당 초당 수축의 관점에서 넣어 수 있습니다.

색인에 ​​수축의 힘이 상대적인 조치는 여러 조건을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 저장된 파일을 하나 마커 "M"을 사용할 수 있으며 그 선에로 이동합니다. 그러면 커서를 사용하여 이동 편향의 정상과 델타 값 (정상에 M의 차이)와 같은 화면의 오른쪽 상단에 나와있는 값을 기록해 둡니다. 커서가 변화의 측정을위한 정지 보관해야합니다. 그렇다면 관심의 다음 물결 양식으로 M을 이동하고 조치를 반복합니다.

Discussion

관련 동영상과 텍스트로 제공되는 세부 사항은 현장에서뿐만 아니라 체외에서 왕새우 hindgut의 활동을 기록하는 데 필요한 주요 단계를 설명합니다. 우리의 보고서 중 하나 목표는 생리학과 약리학의 기본 개념을 가르쳐 조사 연구소를 학생 실행이 준비의 잠재력에 대한 인식을 높일 수 있습니다.

이러한 준비는 hindgut의 생리 기능의 더 나은 이해를 이끌 실험 질문 숫자를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 연동 파도와 그 반전의 규정을 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 전체 GI 트랙트 높은 제어를위한 메커니즘도 완전히 이해되지 않습니다. 높은 센터 직접 GI 시스템을 제어하는 자율 출력 그들의 활동을 통합하는 방법의 문제는 조사의 빈 공간 (Shuranova 외., 2006) 남아 있습니다. 또한, 갑각류 hindgut과 털갈이 및 환경 스트레스 동안 osmoregulation의 기능의 osmoregulatory 기능을 완전히 elucidated되지 않았습니다. 이 준비 답변을 기다리는 많은 질문이있을 수 있습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

켄터키 대학, 생물 학부, 학부 연구과 예술 & 과학 대학 사무실에서 지원됩니다.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  4. Sylgard-bottomed Petri dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Bridge pod for the force transducer (different Bridge pods are required for different types of force transducers).
  8. MLT0402 (2 grams) force transducer is the research grade as shown in the video. MLT 0210/D (10 mg-25 grams) and the MLT 500/A (0-500g) are the educational grades transducers (ADInstruments).

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References

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