La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

* These authors contributed equally
Neuroscience
 

Summary

In questo rapporto si dimostra tecniche che possono essere utilizzati per studiare la biologia del hindgut gamberi. Mostriamo come dissezionare un addome gamberi e studiare l'anatomia associati, la fisiologia e la modulazione di attività. L'attività peristaltica e la forza delle contrazioni sono misurati utilizzando un trasduttore di forza.

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Cooper, A. S., Leksrisawat, B., Gilberts, A. B., Mercier, A. J., Cooper, R. L. Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise. J. Vis. Exp. (47), e2324, doi:10.3791/2324 (2011).

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Abstract

Lo scopo della relazione è di descrivere le tecniche di dissezione per la preparazione del hindgut gamberi e per dimostrare come fare registrazioni fisiologiche con un trasduttore di forza di monitorare la forza di contrazione. Inoltre, ci dimostrano come monitorare visivamente l'attività peristaltica, che può essere usato come un test biologico per diversi peptidi, amine biogene e neurotrasmettitori. Questa preparazione è suscettibile di laboratori studente in fisiologia e farmacologia per dimostrare concetti agli studenti. Questa preparazione è stato in uso da oltre 100 anni, e offre ancora molto come modello per lo studio della generazione e regolazione del ritmo peristaltica e per descrivere i meccanismi alla base della loro modulazione. I saggi farmacologici e di sub-tipizzazione dei recettori che sono stati avviati più di 50 anni fa sul hindgut contribuiscono ancora oggi alla ricerca. Questa preparazione robusto è adatto a studenti di formazione in fisiologia e farmacologia.

Protocol

1. Introduzione

La panoramica più recente completa del hindgut gambero è stato rispettato in una dissertazione dal Dott. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), che si è concentrata principalmente sulla modulazione serotoninergica e innervazione (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crostacei sono stati studiati più di 100 anni fa da Alexandrowicz, un pioniere in anatomia comparata (Alexandrowicz, 1909), che ha descritto i vari aspetti della loro innervazione. La ricerca continua nel corso degli anni, individuando le tipologie di strati muscolari e architettura, affrontando la funzione complessiva del hindgut in osmoregolazione per l'animale intero, ed esaminando il controllo modulazione della contrattilità hindgut da differenti composti (vedi recensione di Musolf, 2007). E 'interessante notare che la parte anale del hindgut agisce non solo per espellere le feci, ma anche a prendere l'acqua dall'ambiente per osmoregolazione. Questa regione dell'intestino può subire avanti o indietro la peristalsi a seconda delle esigenze dell'animale.

Alexandrowicz (1909) ha identificato due plessi nervosi che innervano l'hindgut crostaceo, un plesso interno e un esterno del plesso, che poi si è rivelata una ricca fonte per l'identificazione e la caratterizzazione neurotrasmettitori. Nel 1950 il Dr. Ernst Florey ha iniziato una serie di studi farmacologici sulla hindgut gamberi e ha dimostrato che le contrazioni sono modulati da acetilcolina e composti correlati e anche da epinefrina e norepinefrina (Florey, 1954). Florey, lo scopritore di una sostanza inibitoria conosciuta come "fattore-I", studiato gli effetti della sostanza sulla varie preparazioni, incluso il sistema gastrointestinale a gamberi (Florey, 1961). Factor-I fu poi dimostrato di essere GABA. Così, il gambero di fiume hindgut svolto un ruolo importante nel primi studi di inibizione sinaptica.

In seguito alla scoperta di GABA, altri trasmettitori putativi sono stati anche dimostrato di essere associato con i plessi hindgut e per ottenere risposte fisiologiche. Trasmettitori includono la dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) due peptidi orcokinin (NFDEIDRSGFGFN e AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) e un peptide myosuppressin (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide più probabile, cfr Stemmler et al 2007). Ognuna di queste sostanze modula contrazioni hindgut spontanea, e tutti tranne GABA sembrano essere eccitatori. Il hindgut risponde anche al glutammato e quisqualate (Jones, 1962;. Errato et al 2003), ma chiara evidenza di innervazione glutammatergica non è stato riportato. Messaggeri intracellulari che mediano gli effetti dei vari trasmettitori sono in gran parte inesplorato, ma ci sono prove del coinvolgimento di cAMP nella capacità della dopamina per aumentare le contrazioni (Knotz & Mercier, 1995).

Anche se il hindgut crostaceo contratti spontaneamente dopo denervazione, tali contrazioni sono deboli e disorganizzati (Galles, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Movimento peristaltico richiede potenza del motore coordinato dal sistema nervoso centrale, apparentemente originario degli ultimi ganglio addominale (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). In gamberi di fiume, la potenza del motore viene portato al hindgut attraverso la radice 7 ° addominale, che contiene 75 assoni i cui corpi cellulari sono localizzati nel ganglio ultimi addominale (Kondoh & Hisada, 1986). Almeno alcuni dei peptidi sembrano essere fornita al plesso hindgut provenienti dai neuroni del ganglio ultimi addominale (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), ma la dopamina è fornito da neuroni in più gangli anteriori (Mercier et al. 1991a). Dal potenza del motore attraverso la radice 7 ° addominale è necessaria per i grandi, contrazioni coordinato, è probabile che alcuni o tutti i trasmettitori putativo sopra elencati contribuiscono in qualche modo alla peristalsi. I loro contributi relativi, tuttavia, non sono noti. Alcune informazioni possono essere acquisite attraverso lo studio dei loro effetti sui muscoli circolari e longitudinali separatamente (Mercier & Lee, 2002).

Oltre a controllare il movimento del cibo non digerito, il plesso nervoso associate alla hindgut crostaceo sembra svolgere un importante funzione endocrina associati muta. Il hindgut del granchio, Carcinus maenas, contiene cellule endocrine che rilasciano l'ormone iperglicemico dei crostacei e dei suoi precursori dei peptidi durante ecdysis (Webster et al. 2000), suggerendo un ruolo nella assorbimento di acqua e gonfiore associati muta. Così, il crostaceo hindgut partecipa a diversi importanti processi fisiologici.

Questo rapporto è principalmente uno strumento didattico per avanzati studenti liceali e universitari nei corsi di fisiologia che partecipano alla sperimentazione. L'importanza e il potenziale meccanismo alla base come i contratti hindgut e le funzioni possono essere affrontati dagli studenti. Agenti farmacologici, neurotrasmettitori, neurormoni e saranno utilizzati, e curve dose-risposta sarà costruito, che sarà coinvolgere gli studenti in modo di acquisire e interpretare i dati fisiologici e farmacologici. Una conoscenza generale della funzione dei recettori rispetto agli agonisti e antagonisti possono essere raggiunti. Gli studenti impareranno anche a presentare i dati in forma grafica per l'analisi statistica.

E 'molto facile da analizzare e registrare le contrazioni dalla hindgut gamberi. Nella preparazione sezionato, l'intestino è facilmente esposto a sostanze esogene. L'alterazione dell'attività peristaltica può essere monitorato visivamente o con un trasduttore di forza, che può anche controllare la forza delle contrazioni. A causa della sua semplicità e affidabilità come preparazione biologico, il gambero di fiume hindgut è ancora molto utile per indagare molti interrogativi ricerca sui meccanismi della peristalsi, modulazione della potenza del motore e la contrazione muscolare, e la funzione del recettore. Il hindgut è utile anche per gli insetticidi test, crustaceancides, e inquinanti per i meccanismi specifici di azioni.

2. Metodi

2.1) Materiali

  • gambero
  • gamberi salina
  • strumenti di dissezione (forbici grossolana e fine, grossolana e una pinza sottile)
  • Sylgard a fondo piatto Petri
  • perni in acciaio dissezione
  • bicchieri (di tenere soluzioni chimiche)
  • parafilm (per la copertura di miscelazione e soluzioni)

2.2) La dissezione

  1. Gambero di fiume (Procambarus clarkii) misura 6-10 cm di lunghezza del corpo deve essere collocato in ghiaccio per 5 a 10 minuti per anestetizzare l'animale prima della dissezione comincia.
  2. Tenere il gambero anestetizzato da dietro le unghie con una sola mano. Rapidamente, tagliato dalla presa occhio al centro della testa su entrambi i lati, e poi decapitare i gamberi (Nota: il sangue dalla preparazione sarà appiccicoso quando si asciuga, quindi lavare gli attrezzi una volta completato).
    Figura 1
    Figura 1: Decapitazione di gamberi
  3. Tagliare il chelipeds e le gambe camminando.
  4. Tagliare il alettoni a destra ea sinistra, lasciando solo il tailfin centrale (uropod).
  5. Sul lato dorsale del gambero taglio ventrale sia sul lato destro e sinistro della cuticola dorsale.
    Figura 2
    Figura 2: Rimozione della cuticola dorsali
  6. Tagliati trasversalmente sul lato dorsale della cuticola, facendo in modo che il taglio è superficiale per evitare di danneggiare la GI Quindi rimuovere la parte inferiore della cuticola dorsale addominale.
  7. Mettere i gamberi sezionato in un Sylgard alberato piatto.
  8. Pin i gamberi al piatto sulla punta della pinna caudale. Si può utilizzare più perni su entrambi i lati della GI se necessario per tenere il corpo verso il basso.
  9. Riempire il piatto con soluzione salina gamberi che copre il GI Assicurarsi di spegnere continuamente il GI con soluzione fisiologica con una pipetta. Soluzione salina è una versione modificata di Van Harreveld (1936), che è fatto con 205 mM NaCl, 5.3 mM KCl; 13,5 mm CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES e portato a pH 7.4. Il gambero sezionato dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 3.
    Figura 3
    Figura 3: gamberi Dissected con intatta GI.

2.3) Esperimenti

2.3.1) Le contrazioni nell'animale

  1. Sono soluzioni del composto da testare e pronto alla stessa temperatura del bagno salino. Su potrebbe utilizzare soluzioni individuali di serotonina (100 nM, 1microM), glutammato (1microM), e la dopamina (1microM) ha fatto in soluzione salina gamberi come sostanze di partenza da testare.
  2. Lasciare che il gambero sezionato per sedersi nella soluzione gamberi per circa dieci minuti per permettere di adeguare allo shock della dissezione e l'esposizione salina. Le contrazioni peristalsi lenta dal hindgut dovrebbe iniziare a verificarsi.
  3. Una volta che iniziano le contrazioni, registrare il numero di contrazioni che si verificano in 30 secondi (si noti il ​​tipo di contrazioni che si verificano: tipo peristalsi cioè, o spastica, e la direzione di eventuali onde peristaltiche).
    Tabella 1: contrazioni in gamberi di fiume Saline
    Numero di contrazioni Tipo di contrazioni
  4. Utilizzando un pipipetta, rimuovere la soluzione salina nella cavità dell'addome esposti i gamberi, e applicare salini contenenti la sostanza in esame direttamente sul hindgut.
  5. Subito dopo aver aggiunto la soluzione, registrare il numero di contrazioni che si verificano dopo 30 secondi e prendere nota del tipo di contrazioni che si verificano (cioè peristaltico, o spastica).
    Tabella 2: contrazioni con l'esposizione a composti
    Composto testato Concentrazione Numero di contrazioni Tipo di contrazioni
  6. Immediatamente dopo la registrazione della risposta alla sostanza in esame, lavare i tempi di GI diverse gamberi con soluzione salina normale. Lasciate che la preparazione per 5 minuti, durante il risciacquo circa ogni 30 secondi con soluzione salina gamberi.
  7. Usando una pipetta, posto alcune saline contenenti il ​​composto poi esaminare o una concentrazione della sostanza varia ultimi testato direttamente sul hindgut. E 'meglio cominciare con una concentrazione più bassa e così un lavoro di concentrazioni più elevate.
  8. Immediatamente dopo l'aggiunta di nuove sostanze o di ogni nuova concentrazione, registrare il numero di contrazioni che si verificano dopo 30 secondi e prendere nota del tipo di contrazioni.

2.3.2) le forze di registrazione della contrazione nei preparati escisso

Figura 4
Figura 4: Setup

  1. Fissare il trasduttore al pod ponte.
  2. Collegare il pod ponte verso il 26T PowerLab.
  3. Fissare il 26T PowerLab alla porta USB del computer.
  4. Aperto LabChart7, cliccando sull'icona labchart7 sul desktop.
    • Il Welcome casella Centro LabChart si aprirà. Chiuderlo.
    • Fare clic su Setup
    • Clicca sulle impostazioni dei canali. Modificare il numero di canali a 1 (in basso a sinistra della scatola) premere OK.
    • In alto a sinistra del grafico di cicli al secondo a circa 2k. Impostare il volt (asse y) a circa 500 o 200 mV.
    • Clicca sul canale 1 sulla destra del grafico. Clicca su amplificatore di ingresso. Assicurarsi che le impostazioni: single-ended, accoppiamento AC, e invertire (inverte il segnale, se necessario), e anti-alias, sono controllati.
    • Per iniziare la stampa avviare la registrazione.
  5. Raccogliete la preparazione e taglio del tratto gastrointestinale nella congiuntura tra il torace e l'addome. Poi accuratamente tagliata intorno alla parte telson della coda. Rimuovere il tratto gastrointestinale dal gambero sezionato e metterla nel piatto Sylgard. C'è un vaso sanguigno che corre lungo la faccia dorsale del tratto gastrointestinale. Estrarre con cautela questo lontano dal tratto GI. Versare salina fresca gamberi sulla preparazione.
  6. Posizionare il trasduttore di forza nel morsetto in prossimità del gambero sezionato.
  7. Agganciare il trasduttore di forza nella GI gamberi come mostrato nella Figura 5.
    Figura 5
    Figura 5: hindgut isolata del gambero in soluzione fisiologica attaccato al gancio del trasduttore di forza
  8. Attendere che il GI comincia a contrarsi, e spingere inizio il LabChart7.
  9. Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Spingere "stop", e aggiungere un commento etichettato, "Saline solo". Compila la tabella 4.
    Tabella 4: contrazioni con mescola di interesse
    Numero di contrazioni Ampiezza delle contrazioni (mV)
  10. Aggiungere i composti di prova di interesse, e subito premere "start" sul LabChart7.
  11. Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Premere "stop" e aggiungere un commento direttamente sul file grafico come sostanza a ciò che è stato aggiunto e la sua concentrazione. Compila la tabella qui sotto.
    Tabella 5: contrazioni con mescola _________
    Numero di contrazioni Ampiezza delle contrazioni (mV)
  12. Risciacquare la preparazione con soluzione salina gamberi con una pipetta.
  13. Aggiungere altre sostanze o varie concentrazioni in un modo simile. Immediatamente spinta "start" sul LabChart7.
  14. Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Spingere "stop", e aggiungere un commento e l'etichetta direttamente sul file grafico che indica la compound utilizzati e la concentrazione.

3. Analisi dei dati

  1. Da 2.3.1 dell'esperimento, grafico il numero di contrazioni di ogni soluzione (fisiologica, serotonina, glutammato) in funzione del tempo. Spiegare le tendenze.
  2. Da 2.3.2 dell'esperimento, grafico il numero di contrazioni di ogni soluzione (fisiologica, serotonina, glutammato) vs l'ampiezza delle contrazioni in mV. Spiegare le tendenze.

3.1) misura la velocità e la forza delle contrazioni

Per indicizzare il tasso di contrazione in grado di misurare il tempo dall'inizio su una flessione all'inizio del prossimo o contare le deviazioni totale di più di un minuto o due. I valori possono poi essere messo in termini di contrazioni al minuto o secondo per secondo quanto rapida che si stanno verificando.

Per indicizzare la forza delle contrazioni una misura relativa potrebbe essere utilizzato per confrontare diverse condizioni. Sul file salvato si può utilizzare il marcatore "M" e passare alla linea di base. Quindi utilizzare il cursore e passare al picco della deflessione e prendere nota del valore indicato in alto a destra dello schermo come un valore delta (la differenza da M a picco). Si noti il ​​cursore deve essere tenuto fermo per la misura del cambiamento. Quindi spostare il M alla forma nuova ondata di interesse e ripetere la misura.

Discussion

I dati forniti nel film associati e testo descrivono i passaggi chiave necessari per registrare l'attività nel hindgut del gambero in situ e in vitro. Uno degli obiettivi della nostra relazione è quello di aumentare la consapevolezza del potenziale di questa preparazione a studenti conduzione laboratori investigativi che insegnano concetti fondamentali di fisiologia e farmacologia.

Queste preparazioni possono essere utilizzate per indagare su una serie di domande sperimentale che porterà a una migliore comprensione delle funzioni fisiologiche del hindgut. I meccanismi alla base della regolamentazione onde peristaltiche e la loro inversione non sono ancora noti. I meccanismi di maggiore controllo dell'intero tratto gastrointestinale sono, inoltre, non pienamente compresi. La questione di come centri superiori integrare la propria attività con l'uscita autonomo che controlla direttamente il sistema gastrointestinale rimane uno spazio aperto di indagine (Shuranova et al., 2006). Inoltre, la capacità di osmoregolazione del hindgut crostacei e le funzioni di osmoregolazione durante lo stress muta e ambientali non sono stati completamente chiariti. Ci sono ancora molte domande in attesa di risposte in questa preparazione.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Supportato da University of Kentucky, Dipartimento di Biologia, Ufficio di studi universitari e il College of Arts & Sciences.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  4. Sylgard-bottomed Petri dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Bridge pod for the force transducer (different Bridge pods are required for different types of force transducers).
  8. MLT0402 (2 grams) force transducer is the research grade as shown in the video. MLT 0210/D (10 mg-25 grams) and the MLT 500/A (0-500g) are the educational grades transducers (ADInstruments).

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References

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