أسلوب Alternant لنموذج ناسا التقليدية تفريغ Hindlimb في الفئران

Biology
 

Summary

طورنا hindlimb alternant تفريغ النموذج في الفئران. الميزة الرئيسية لدينا وسيلة hindlimb الذيل الدائري التفريغ خلال تقنية التقليدية الذيل الجر موري هولتون ، هو إجراء بسيط مباشر أن يقلل الإجهاد على الحيوان.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وموري ، هولتون hindlimb التفريغ (HU) الأسلوب هو مقبول على نطاق واسع الوطنية للملاحة الجوية والفضاء الأميركية (ناسا) أرضية نموذجية لدراسة الترك ، ضمور في القوارض و 4-6. دراستنا تقييم أسلوب alternant إلى معيار الذهب موري - هولتون أسلوب جر الذيل هو جين تاو فى الفئران. وكانت أربعة وخمسين إناث الفئران (4-8 مو). HU لمدة 14 يوما (ن = 34) أو 28 يوما (ن = 20). وجرى تقييم التعافي من الخليل بعد 3 أيام من العمل بشكل طبيعي بعد التمشي القفص هو (22 = ن). خدم الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران المتطابقة (ن = 76) وتحمل الوزن الضوابط.

قبل HU تم تشكيل عصابة الذيل 2-0 العقيمة مع أسلاك الفولاذ الجراحية التي تم تمريرها من خلال ال 5 و ال 6 أو ال 7 بين مساحة القرص الفقري وظهر على شكل حلقة التي تم تعليقها من الفئران. وقد تم اختيار الموقع الفقري لعصابة الذيل لتحقيق التوازن بين وزن الجسم بشكل مناسب الحيوان من دون التدخل في التغوط.

نحن مصممون على نجاح هذه التقنية HU رواية تقييم وزن الجسم قبل وبعد HU ، ودرجة ضمور النعلية ، والغدد الكظرية HU الشامل التالي. ولم وزن الجسم من الفئران قبل HU (24.3 ± 2.9g) لا تراجع بشكل ملحوظ على الفور بعد 14D هو جين تاو (22.7 ± 1.9g) ، 28D هو جين تاو (21.3 + 2.1g) أو بعد 3 أيام الانتعاش (24.0 ± 1.8g) . النعلية كتلة العضلات انخفضت بشكل ملحوظ (-39.1 ٪ ، و -46.6 ٪) في أعقاب HU لمدة 14 يوما و 28 يوما على التوالي (P <0.001). بعد 3 أيام من الانتعاش الشامل النعلية زيادة كبيرة لتصل إلى 74 ٪ من قيم السيطرة. وأوزان الخليل الكظرية من الفئران لا تختلف بالمقارنة مع الفئران السيطرة.

ومما يدل على نجاح الرواية لدينا طريقة لصيانة HU من وزن جسم الحيوان ، مقارنة أوزان الغدة الكظرية ، وضمور النعلية التالية HU الموافق الأدب القيم المتوقعة 2 و 7 و 8. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب HU ما يلي : 1) سهولة فحص الذيل أثناء التعليق ، 2) انخفض احتمال ذيول مزرقة ، ملتهبة ، و / أو نخرية وحظ في كثير من الأحيان مع تسجيل الذيل وHU ، 3) أي إمكانية لمضغ الفئران الجر الشريط والخروج من جهاز التعليق ، و4) الانتعاش السريع والعادي النشاط قفص فورا بعد HU.

Protocol

قبل الجراحة آلات / مواد

  • قواطع للاسلاك / كماشة
  • الشاش 2 × 2 "منصات
  • التدفئة الوسادة
  • العصي نترات الفضة
  • الجراحية القفازات المعقمة
  • Isoflurane استنشاق مخدر
  • غلوكونات الكلورهيكسيدين 4 ٪ (فرك الجراحية مطهر)
  • معقمة 2-0 خياطة الجراحية الصلب
  • 25 X 08/05 إبرة قياس (المعقمة)
  • مرقئ (المعقمة)
  • الجراحية الصلب خياطة

جراحة الداخلي

  1. إنشاء حقل معقمة. اتبع الإجراءات العقيمة.
  2. تخدير الماوس مع 2 -- 3 ٪ isoflurane.
  3. مكان الماوس على وسادة التدفئة.
  4. فرك الذيل مع حل الكلورهيكسيدين.
  5. موقع 5 ، 6 أو 7 الفضائية عشر الفقرية (بين اثنين من المطبات العظمية على الذيل ، وبدء العد من نهاية الشعر الجسم ، وعلى قاعدة الذيل).
  6. استخدام إبر والمرقأة 25G لجعل ثقب التجريبية بين فقرتين ، في الفضاء الفقرية.
  7. استخدام تقطيعها الى قطع اسلاك الصلب الدرز 10 سم طويلة.
  8. إزالة الإبرة والخيط الصلب من خلال ادخال ثقب ، 5 سم من الخيط على أي نهاية الذيل.
  9. يجب على كل من جانبي الذيل و+ 5 سم من الخيط.
  10. مكان طرف الإبهام على الذيل.
  11. استخدام يدك الحر والرياح خياطة الصلب على غيض من الإبهام وتحريف تاريخ لتشكيل حلقة كبيرة. وينبغي أن الجزء الجرح أو دائرية تكون + 3 مم.
  12. إزالة الإبهام.
  13. المشبك one حبلا من الدرز مع مرقئ وثنيه في أصغر حلقة ، ونهاية وهي مرفقة قدر الإمكان إلى تطور كبير في حلقة الأصلي.
  14. قطع الأسلاك الزائدة ، وثني الأسلاك الملتوية الى الوراء.
  15. إذا كان هناك أي نزيف الزائد ، يمكن أن تقوم بإيقافه مع العصي نترات الفضة.
  16. إيقاف الماوس isoflurane ووضعه في قفص بيت واحد لاستعادة لمدة 5-7 أيام قبل hindlimb التفريغ. الحلقات الذيل التورط في حال إيواء أكثر من الماوس معا.

1. Hindlimb التفريغ الداخلي

المواد

  • حجم 10-24 X 4 براغي آلة ، واحدة للحيوان الواحد.
  • نايلون قفل الجوز حجم 10-24 ، واحدة للحيوان الواحد.
  • الجناح الجوز حجم 10 × 24 ، واثنين من حيوان الواحد.
  • حجم غسالة ¼ X 1 ، واثنين من حيوان الواحد.
  • قطب الصيد مع حجم هوك المفاجئة # 6 ، 1-11/16 "، وحيوان واحد في المائة.
  • ماكينة خياطة بكرة معدنية. حيوان واحد في المائة.
  • مشبك الورق الصغيرة ل S - شكل خطاف ، واحدة للحيوان الواحد
  • كماشة.
  • 2 × 2 "الشاش.
  • 2 "ورقة سوداء الموثق المشابك.
  • قناة الشريط / مختبر الشريط.
  • 1-3/8 "مطلي قضيب من الفولاذ الذي يمتد مشقوق قليلا بعد طول كامل من القفص
  • 50cm X 40cm س 20cm قفص (قفص الفئران).
  • زجاجة ماء مع أنبوب محني.
  • غير القابل للصدأ أسلاك الفولاذ على شكل حرف U لدعم زجاجة المياه.

قفص الإعداد

  1. وضع "شريط 1-38 مطلي الصلب سدد فوق الجزء العلوي من القفص ، وشريط لاصق عليه زمنيا مع شريط لاصق.
  2. 1 المسمار الجوز الجناح المسمار الآلة ، اضافة الى وجود غسالة ، وإدراج حوض الآلة المسمار مسطحات الصلب مشقوق ± 15 سم من حافة القفص.
  3. إضافة آخر غسالة والجوز الجناح. تشديد المكسرات كلا الجناحين ، ولكن لا تشديد تماما ، لأنه سيكون من الضروري القيام التعديلات في وقت لاحق.
  4. إدراج برغي آلة من خلال ثقب وسط بكرة.
  5. لمنع بكرة من السقوط ، المسمار الجوز قفل النايلون حتى نهاية المسمار الجهاز. يجب على بكرة دوارة بحرية.
  6. تضاف هوك المفاجئة من دوار الصيد من خلال الجزء السفلي للمكوك.
  7. استخدام كماشة لتشكيل هوك S - شكل من مشبك الورق. (قص 2cm من مشبك الورق لتشكيل هوك).
  8. إدراج واحدة من نهاية هوك S - شكل من خلال ثقب في دوار الصيد وقرصة انها اغلقت مع كماشة.
  9. وضع سلك على شكل حرف U ، بالتوازي مع آلة المسمار ، في الداخل من جانب القفص ، والانحناء مرة أخرى إلى نهايات دعم زجاجة ماء كامل.
  10. إدراج زجاجة ماء في السلك على شكل حرف U ، مع spicket أسفل ، ولكن لا تلمس القاع.
  11. ثني 2 "الموثق المشبك مفتوحة ، بحيث لا يمكن إيقاف قريبة. التوتر فقط بما يكفي لاجراء 3-4 قطعة من المواد الغذائية في أنه دون ذلك سقوطه ، وهذا هو منع القوة من المشبك من سحق الطعام ، أو تضييق الخناق على الماوس الأنف.
  12. مكان 3-4 قطعة من طعام القوارض في المشبك الموثق.

Hindlimb تفريغ ماوس

  1. إدراج نهاية مفتوحة للربط على شكل S من خلال حلقة صغيرة من الحلبة الذيل.
  2. ضبط ارتفاع الماوس من خلال تشديد أو تخفيف الجوز الجناح السفلي المسمار على الجهاز. ينبغي أن لا يكون السفلية تحمل الوزن. متى تم تحقيق ارتفاع الأمثل تشديد الجوز الجناح العلوي.
  3. إعادة وضع زجاجة الماء ، والأسلاك على شكل حرف U بحيث الماوس لا يمكن الصعود الى spicket مع hindlimbs والخمسين. تأمين زجاجة الماء مع شريط لاصق لجانب من القفص.
  4. موقف الشبك الموثق مع الطعام على الجزء السفلي من القفص بحيث الماوس لا يمكن الصعود إليها ؛ الشريط عليه مع شريط لاصق.
  5. كرر نفس الإجراء إذا تم تفريغ hindlimb أكثر من حيوان واحد على الجانب الآخر من القفص. منزل حيوانين في قفص ؛ الفضاء الحيوانات بحيث يمكن تلمس ما يقرب من بعضها البعض.
  6. استخدام الشاش 2 X 2 فضفاضة للالتفاف ذيل الفأر معه الى دوار السمك. استخدام قطعة صغيرة من الشريط للالتفاف حول الشاش ، وتأمين شاش إلى الذيل. هذه الخطوة مهمة للحيلولة دون ذيل تدلى من الهبوط ، مما يؤدي إلى تجمع الدم في طرف الذيل والذيل أن تصبح نخرية.
  7. إضافة كمية صغيرة من الفراش الكوز إلى القفص. لا تضيف الكثير من الفراش وإلا سوف الماوس من كومة من الفراش ومحاولة لتحميل hindlimbs على الفراش.

2. ممثل النتائج :

لإنشاء نجاح تقنية HU الذيل الدائري قمنا بقياس وزن الجسم الحيوان قبل الذيل جراحة الطوق ، وقبل وبعد هو والانتعاش ؛ النعلية كتلة العضلات ، والغدة الكظرية الشامل في جميع الفئات.

وتظهر وزن الجسم من الفئران في كافة مراحل التجربة في الشكل 1. وكان وزن الجسم من الفئران قبل عصابة الذيل لعملية جراحية (24.7 ± 3.5G) لا تختلف كثيرا بعد 5 أيام من التعافي من الجراحة عصابة الذيل (24.3 ± 2.9g) قبل هو جين تاو. ولم انخفاض وزن الجسم بشكل ملحوظ على الفور بعد 14 يوما من الخليل (22.7 ± 1.9g) ، و 28 يوما من الخليل (21.3 + 2.1g) أو بعد 3 أيام من الانتعاش HU (24.0 ± 1.8g) على الرغم من أن هو جين تاو الى 14 و 28 يوما أسفرت عن خسارة صغيرة (-6.8 ٪ و 12 ٪) ، ولكن غير مهمة في كتلة الجسم ، فإن الفئران تعافى تماما من ما كانت عليه قبل HU وزن الجسم بعد 3 ايام من الانتعاش. ويبين الاستهلاك الغذائي للفئران والجرذان السيطرة المتنقلة HU في الشكل 3. وكان متوسط ​​الاستهلاك الغذائي اليومي لا تختلف في الفئران HU أكثر من 28 يوما مقارنة مع الضوابط.

لاحظنا ضمور العضلات الكبيرة النعلية HU التالية لمدة 14 و 28 يوما (-39.1 ٪ -46.6 ٪ و) التي تشير إلى إجراء HU فعالة (الشكل 2). وعلاوة على هذه الدرجة من ضمور يتسق مع القيم الأدب المتوقع لمدة 2-4 أسابيع من HU 2 ، 7 ، 8. بعد 3 أيام من التعافي من HU النعلية الشامل زيادة كبيرة لتصل إلى 74 ٪ من قيم السيطرة. وكان النعلية الشامل في مجموعة استرداد أكبر بكثير من الجماعات HU على حد سواء ، لكنها ما زالت أقل بكثير من الحيوانات السيطرة الخارجية.

تم قياس الأوزان الكظرية كمؤشر على التوتر الحيوان ، وكلاهما تم رفعه في الغدد الكظرية اليمنى واليسرى وزنه. وكان متوسط ​​الأوزان مماثلة لمكافحة الفئران والجرذان HU في جميع الفئات (الشكل 4).

سبق لنا في الفئران أظهرت أن نسبة النجاح لعدد من الحيوانات في بداية HU بالمقارنة مع عدد من الحيوانات التي أنجزت HU دون الخروج من جهاز التعليق (بسبب مضغ الحيوانات من خلال الشريط الذيل الجر) وكان 10 من أصل من 12 باستخدام تقنية موري هولتون - 1. أي من الفئران (ن = 54) وجاء في هذه الدراسة من أي وقت مضى إلى أسفل من تعليق قبل الانتهاء من فترة هو جين تاو. فعلنا ومع ذلك ، واحد التي وضعت الماوس الذي ذيل ملتهبة بشدة. أزلنا عندما أصبح واضحا الالتهاب ، وخاتم الذيل للسماح للمنطقة ملتهبة للشفاء ، ووضع في وقت لاحق آخر الذيل الدائري لإكمال مدة HU.

في الماضي عندما يكون لدينا استخدام الأسلوب موري - هولتون هو جين تاو ، ونحن عادة القضاء على الفئران 02/01 / المجموعة لأنها تخرج من جهاز التعليق. مع أسلوب درب الحلقة لم يكن هناك من الفئران الحلقات المقبلة من دون قصد الجهاز هو جين تاو خلال الفترة من الخليل لمدة 14 أو 28 يوما (ن = 54 الفئران).

الشكل 1
الرقم وزن الجسم 1. التغييرات (متوسط ​​± SD). الاختصارات : CON : الفئران الحاملة للتحكم في وزن الجسم (ن = 76) ؛ التمهيدية هو : كل الفئران قبل HU (ن = 54) ؛ HU14 : الفئران hindlimb تفرغ لمدة 14 يوما (ن = 34) ؛ HU28 : الفئران hindlimb لتفريغ 28 يوما (ن = 20) ؛ REC : الفئران hindlimb تفريغ يسمح لاسترداد قفص لمدة 3 أيام (ن = 22). لم يلاحظ أي اختلافات كبيرة في وزن الجسم بين المجموعات.

الشكل 2
الرقم عضلة النعلية 2. ضمور (متوسط ​​± SD). الاختصارات : CON : الفئران الحاملة للتحكم في وزن الجسم (ن = 76) ؛ HU14 : الفئران hindlimb تفرغ لمدة 14 يوما (ن = 34) ؛ HU28 : الفئران hindlimb تفرغ لمدة 28 يوما (ن = 20) ، ونادي السباق والفروسية : الفئران hindlimb تفريغ سمحت لاسترداد قفص لمدة 3 أيام (ن = 22). * تختلف اختلافا كبيرا (ع <0.001) من تحمل الوزن التحكم (CON). δSignificantly مختلفة (ع <0.01) من المجموعات HU على حد سواء.

467fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "/>
استهلاك الأغذية الرقم 3 (متوسط ​​± SD). متوسط ​​الاستهلاك الغذائي اليومي (غ / يوم) خلال تحمل الوزن وتفريغ hindlimb. الاختصارات : الفئران الحاملة للتحكم في وزن الجسم (ن = 76) ؛ HU : الفئران hindlimb unloaded14 -- 28 يوما. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات وCON هو جين تاو.

الشكل 4
الشكل 4. القداس الكظرية (متوسط ​​± SD). الاختصارات : CON : الفئران الحاملة للتحكم في وزن الجسم (ن = 76) ؛ HU14 : الفئران hindlimb تفرغ لمدة 14 يوما (ن = 34) ؛ HU28 : الفئران hindlimb تفرغ لمدة 28 يوما (ن = 20) ، ونادي السباق والفروسية : الفئران hindlimb تفريغ سمحت لاسترداد قفص لمدة 3 أيام (ن = 22). لم يلاحظ أي اختلافات كبيرة بين المجموعتين.

Discussion

قمنا بتقييم أسلوب بديل من الفئران hindlimb التفريغ ، ونحن مصممون على أن تكون ناجحة للغاية. وقد استخدم الأسلوب الدائري الذيل كما هو موضح هنا للتعليق hindlimb طويلة الأجل ، ودراسة HU الانتعاش التالية. تحت كل هذه الظروف ، لم يكن هناك أي دليل على الفشل في التكيف كما يتضح من تناول الأغذية مستقرة ، ووزن الجسم ، والأوزان الكظرية للفئران. هذه التقنية HU الذيل عصابة من السهل القيام بها ويمكن بسهولة أن تدمج مع الممارسة الجراحية القليل جدا.

هناك العديد من المزايا من الذيل الدائري أسلوب مقارنة بالطريقة التقليدية 6 - موري هولتون 5. أولا ، والجلد وخاتم موقع غرس على هذا الذيل دائما مرئية ، حتى إذا تنشأ مشاكل يتضح على الفور ، وليس فقط في نهاية فترة التعليق. الثانية ، والحيوانات ليست قادرة على الخروج من جهاز التعليق في أي وقت خلال HU ، تنتفي الحاجة إلى اتخاذ قرار ما إذا كان للحفاظ على الماوس أو ليست في مجموعة بيانات. وعلاوة على ذلك ، فإن الفئران لا يزعج جهاز الرنين وعندما يتم اطلاق سراحهم من HU للانتعاش ، لا تعبث مع ذيولها ، والسماح لمرحلة الانتعاش التالية السلس هو جين تاو. أخيرا ، والفئران تفريغ hindlimb مع أسلوب الذيل الدائري الحفاظ على وزن الجسم بشكل أفضل من الفئران hindlimb تفريغها بواسطة تقنية الذيل الجر موري - هولتون. في ايدينا بعد 14 يوما من HU احظنا خسارة صغيرة (-6.8 ٪) ، ولكن غير مهمة في كتلة الجسم. بينما لاحظ آخرون إينغلس. انخفاضا كبيرا في -12 ٪ من وزن الجسم في الفئران بعد 14 يوما من HU بواسطة الأسلوب موري هولتون - 3. على الرغم من أن التقرير لم إينغلس الأوزان الكظرية ، ويبدو أن لدينا الذيل الدائري أسلوب يمنح أقل من الضغط على الفأرة (أوزان الفئران في الغدة الكظرية هو جين تاو ان لا تختلف من الضوابط) وصيانة أفضل من وزن الجسم خلال فترة hindlimb التفريغ.

باختصار ، تم تطوير أسلوب عصابة الذيل تفريغ hindlimb واختباره على الفئران لHU 14 و 28 يوما ، وعلى الفئران عاد الى الانتعاش قفص لمدة 3 أيام بعد HU. على أساس الأوزان الكظرية ، وكتلة الجسم وتناول الطعام ، ويبدو أن الفئران تكيفت جيدا لجهاز الذيل الدائري. وhindlimb الذيل الدائري تفريغ الأسلوب هو مفيد وبسيط لالبديلة التقليدية موري - هولتون تقنية التفريغ hindlimb.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر أندرو جونسون دان ، وهو طالب البحوث الجامعية البارزة في المختبر لدينا ، للحصول على المساعدة الفنية له ورعاية الحيوانات. بتمويل من المعهد الوطني للصحة منح HD058834 وجامعة ميسوري للعلوم زمالة الحياة هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wire cutters/pliers Ace Hardware 84-056
Gauze Fisher Scientific 22-037-901
Heating pad Sunbeam Z-1228-001
Silver nitrate applicators ARZOL 0001-2
Isoflurane,USP Novaplus NDC 0409-3292-49
Chlorhexidine Gluconate 4% Purdue Products L.P. NDC 67618-200-01
Sterile 2-0 surgical steel suture Ethicon Inc. SS-28
25 X 5/8 A gauge needle Terumo Medical Corp. NN 2516R
Hemostat/ needle holder Fine Science Tools 12500-12
Size 10-24 X 4 machine screws Hillman The Fastener Center 90272
Nylon lock nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180141
Wing nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180243
Fender Washer size ¼ X 1 Hillman The Fastener Center 290012
Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” Bass Pro Shop 38-481-554-01
Metal sewing machine bobbin. Singer Instruments 45785
Paper clip Office Depot 221720
2” black paper binder clamps. Office Depot 308957
Scotch Multi-Use Duct Tape Office Depot 790710
1-3/8” Plated slotted steel bar Home Depot 548932 Extends slightly beyond the full length of the cage
50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage Alternative Design Manufacturing RC88D-PC
Water Bottle Alternative Design Manufacturing WB16FS
Stainless Steel wire Small Parts, Inc. SWX-4029 U-shaped wire to support water bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
  2. Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
  3. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
  4. Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
  5. Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
  6. Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
  7. Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
  8. Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).

Comments

2 Comments

  1. Is it possible to apply such a method to rat?
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Christian C.
    March 19, 2013 - 12:22 PM
  2. Yes!!
    We have tried this method in both species and have the same results.

    Reply
    Posted by: Johan F.
    March 19, 2013 - 2:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics