Eine alternierende Methode, um die traditionelle NASA Hinterlauf Entladen Modell in Mäusen

Biology
 

Summary

Wir entwickelten eine alternierende Hinterlauf Entladen Modell bei Mäusen. Der Hauptvorteil unserer Hinterlauf Entladen tail-Ring-Methode gegenüber der herkömmlichen Morey-Holton tail-Traktion-Technik ist eine einfache, klare Verfahren, dass Stress minimiert auf das Tier.

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Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

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Abstract

Die Morey-Holton Hinterlauf Entladen (HU)-Methode ist eine allgemein anerkannte National Aeronautics and Space Administration (NASA) Boden-basiertes Modell für die Untersuchung Nichtnutzung-Atrophie bei Nagetieren 4-6. Unsere Studie untersuchte eine Alternante Methode, um die Gold-Standard Morey-Holton HU tail-Traktion Technik bei Mäusen. Vierundfünfzig weiblichen Mäusen (4-8 mo.) Wurden HU für 14 Tage (n = 34) oder 28 Tage (n = 20). Erholung von HU wurde nach 3 Tagen von normalen Käfig Gehfähigkeit nach HU (n = 22) untersucht. Aged abgestimmt Mäusen (n = 76) diente als Gewicht tragenden Kontrollen.

Vor HU einen Schwanz Ring wurde mit einem 2:0-sterilen chirurgischen Stahldraht, die durch die 5 th, 6 th, oder 7 th Bandscheibe Raum übergeben wurde und geformt zu einem Ring, von dem die Mäuse ausgesetzt wurden gebildet. Vertebral Standort für den Schwanz-Ring wurde ausgewählt, um angemessen Balance Körpergewicht des Tieres, ohne sich mit Stuhlgang.

Wir haben festgestellt, den Erfolg dieses Romans HU Technik, die von der Beurteilung des Körpergewichts vor und nach der HU, den Grad der soleus Atrophie und Nebennieren Masse folgende HU. Das Körpergewicht der Mäuse vor der HU (24,3 ± 2,9 g) nicht signifikant sofort Rückgang nach 14d der HU (22,7 ± 1,9 g), 28d der HU (21,3 + 2,1 g) oder nach 3 Tagen Erholung (24,0 ± 1,8 g) . Soleus Muskelmasse deutlich zurückgegangen (-39,1%, -46,6% und) folgende HU für 14 Tage und 28 Tage (p <0,001). Nach 3-tägiger Erholung soleus Masse deutlich auf 74% der Kontrollwerte. Adrenal Gewichte der HU-Mäuse unterschieden sich nicht im Vergleich zu Kontrolltieren.

Der Erfolg unserer neuen HU-Methode wird durch die Pflege von Körpergewicht des Tieres, vergleichbar Nebenniere Gewichte und soleus Atrophie folgenden HU, entsprechend zu erwarten Literatur Werte 2, 7, 8 belegt. Die Hauptvorteile dieser HU-Methode sind: 1) einfache Schwanz Prüfung beim Einhängen, 2) verringert die Wahrscheinlichkeit von Zyanose, entzündet, und / oder nekrotischen Schwänzen häufig mit tail-Taping und HU beobachtet, 3) keine Möglichkeit, Mäuse Kauen der Traktion Tape und Coming-out der Aufhängevorrichtung und 4) eine schnelle Heilung und normale Käfig Aktivität unmittelbar nach HU.

Protocol

Pre-Chirurgie-Instrumente / Materialien

  • Drahtschneider / Zange
  • Gauze 2 x 2 "-Pads
  • Heizkissen
  • Silbernitrat-Sticks
  • Sterile OP-Handschuhe
  • Isofluran Inhalationsnarkose
  • Chlorhexidingluconat 4% (Antiseptische chirurgische Macchia)
  • Sterile 2-0 chirurgischem Stahl Naht
  • 25 X 5 / 8 A-Gauge-Nadel (autoklaviert)
  • Hemostat (autoklaviert)
  • Chirurgischer Stahl Naht

Chirurgie Procedure

  1. Erstellen Sie einen sterilen Bereich. Folgen Sie sterile Verfahren.
  2. Anesthetize Maus mit 2 bis 3% Isofluran.
  3. Bewegen Sie die Maus auf dem Heizkissen.
  4. Scrub Schwanz mit Chlorhexidin-Lösung.
  5. Suchen Sie 5, 6, oder 7 th Zwischenwirbelraum (zwischen zwei knöchernen Höcker auf Schwanz, dem Zählen beginnen ab Ende der Körperbehaarung, an der Basis der Schwanz).
  6. Verwenden Sie Hemostat und 25G-Nadel auf eine Pilotbohrung zwischen zwei Wirbeln zu machen, in den Zwischenwirbelraum.
  7. Verwenden Sie die Drahtschere auf die Stahl-Naht 10 cm langen Schnitt.
  8. Entfernen Sie die Nadel und stecken Stahl Naht durch das Loch, 5 cm der Naht auf beiden Seiten des Schwanzes.
  9. Jede Seite des Schwanzes sollte + 5 cm der Naht.
  10. Legen Sie Ihren Daumen Spitze auf Schwanz.
  11. Verwenden Sie Ihre freie Hand und Wind die Stahl-Naht auf die Spitze des Daumens und die Enden zu einem großen Schleife zu bilden. Die Wunde oder kreisförmigen Teil sollte + 3 mm lang sein.
  12. Nehmen Sie Ihren Daumen.
  13. Clamp einem Strang der Naht mit dem hemostat und biegen sie in eine kleinere Schlinge, deren Ende so eng wie möglich ist, die Wendung auf die ursprüngliche große Schleife angebracht.
  14. Cut off überschüssigen Draht und biegen Sie die verdrillten Draht zurück.
  15. Wenn es einen Überschuss Blutungen, können Sie es mit der Silbernitrat-Sticks zu stoppen.
  16. Schalten Sie die Isofluran und Ort Maus in einem Einfamilienhaus Käfig für 5-7 Tage vor dem Hinterlauf Entladen zu erholen. Der Schwanz Ringe verfangen, wenn mehr als eine Maus zusammen untergebracht ist.

1. Hinterlauf Entladevorgang

Materialien

  • Größe 10-24 x 4 Schrauben, je eine pro Tier.
  • Nylon Kontermutter Größe 10 bis 24, je eine pro Tier.
  • Flügelmutter Größe 10 X 24, zwei pro Tier.
  • Washer Größe ¼ X 1, zwei pro Tier.
  • Angeln Wirbel mit Karabinerhaken Größe # 6, 1-11/16 ", und man pro Tier.
  • Metall-Nähmaschine Spule. Einer pro Tier.
  • Kleine Büroklammer zum S-förmigen Haken, eine pro Tier
  • Zangen.
  • 2 x 2 "Gaze.
  • 2 "schwarzes Papier Bindemittel Klammern.
  • Klebeband / lab Band.
  • 1-3/8 "Plated geschlitzten Stahlstange, die etwas über die volle Länge des Käfigs reicht
  • 50cm x 40cm x 20cm Käfig (Rattenkäfig).
  • Trinkflasche mit gebogenem Rohr.
  • Edelstahl-Draht, U-förmig, um Wasserflasche zu unterstützen.

Cage-Setup

  1. Legen Sie den 1-38 "Plated geschlitzten Stahl bar über der Oberseite des Käfigs, und kleben Sie es zeitlich unten mit Klebeband.
  2. Schraube 1 Flügelmutter an der Maschine Schraube, legen Sie eine Scheibe, und legen Sie die Maschine Schneckentrog den geschlitzten Stahlplatte ± 15 cm vom Rand des Käfigs.
  3. Add another Unterlegscheibe und Flügelmutter. Ziehen Sie die beiden Flügelmuttern, aber nicht ganz festziehen, wie es nötig ist, um Anpassungen später tun.
  4. Legen Sie die Maschine Schraube durch das mittlere Loch der Spule.
  5. Um zu verhindern, die Spule herunterfallen, schrauben Sie die Nylon-Sicherungsmutter bis zum Ende der Maschine Schraube. Die Spule sollte frei drehen.
  6. Legen Sie die Karabinerhaken aus den Angeln Schwenk durch den unteren Teil der Spule.
  7. Mit einer Zange eine S-förmige Haken von der Büroklammer zu bilden. (Cut 2cm von der Büroklammer an einen Haken zu bilden).
  8. Legen Sie das eine Ende des S-förmigen Haken durch das Loch des Fischerdorfes schwenk-und kneifen sie geschlossen mit der Zange.
  9. Legen Sie die U-förmigen Draht, parallel zur Maschine Schraube, an der Innenseite des Käfigs Seite und biegen Sie die Enden wieder auf eine volle Wasserflasche zu unterstützen.
  10. Legen Sie die Flasche Wasser in die U-förmigen Draht, mit dem Spicket nach unten, aber nicht den Boden berührt.
  11. Biegen Sie die 2 "Bindemittel Klammer zu öffnen, so dass sie nicht in der Nähe geschlossen. Gerade genug Spannung, um 3 bis 4 Stücke von Lebensmitteln in ihr zu halten, ohne sie fallen aus. Dies verhindert, dass die Kraft der Klemme vom Zerkleinern der Nahrung oder ein strengeres Vorgehen gegen der Maus die Nase.
  12. Legen Sie 3 bis 4 Stücke von Nagetier chow in das Bindemittel zu klemmen.

Hinterlauf Entladen von Maus

  1. Legen Sie das offene Ende des S-förmigen Haken durch den kleineren Ring des Schwanzes Ring.
  2. Stellen Sie die Maus Höhe durch Anziehen oder Lösen der unteren Flügelmutter an der Maschine Schraube. Die unteren Extremitäten sollte kein Gewicht tragen werden. Sobald die optimale Höhe erreicht ziehen Sie die obere Flügelmutter.
  3. Positionieren Sie die Wasserflasche, und U-förmigen Draht, so dass die Maus nicht auf die Spicket klettern mit ihren Hinterbeinen. Sichern Sie die Wasserflasche mit Klebeband an der Seite des Käfigs.
  4. Position des Bindemittels Schelle mit Essen auf den Boden des Käfigs, so dass die Maus nicht auf ihn zu besteigen, Band ihn mit Klebeband.
  5. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn mehr als ein Tier ist Hinterbein auf der anderen Seite des Käfigs entladen. Haus zwei Tiere pro Käfig; Raum die Tiere so, dass sie fast berühren kann sich gegenseitig.
  6. Verwenden Sie die 2 X 2 Gaze lose wickeln den Schwanz der Maus auf die Fische zu schwenken. Mit einem kleinen Stück Klebeband, um rund um die Gaze wickeln, die Sicherung der Gaze auf den Schwanz. Dieser Schritt ist wichtig, um den Schwanz von hängenden nach unten zu verhindern, was zu Blut-Pooling in der Spitze des Schwanzes und Schwanz es nekrotisch.
  7. Fügen Sie eine kleine Menge von cob Betten in den Käfig. Fügen Sie nicht zu viel Einstreu sonst die Maus aus einem Haufen Bettzeug und versuchen, Hinterbeine auf Einstreu zu laden.

2. Repräsentative Ergebnisse:

Zur Ermittlung der Erfolg der Schwanz-Ring HU Technik, die wir gemessen Körpergewicht des Tieres vor dem Schwanz Ring Chirurgie und vor und nach der HU und Verwertung; soleus Muskelmasse und Nebennieren Masse in allen Gruppen.

Das Körpergewicht der Mäuse während des Experiments sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Körpergewicht der Mäuse vor dem Schwanz Ring Chirurgie (24,7 ± 3,5 g) unterschieden sich nicht signifikant nach 5 Tagen der Erholung von der Schwanz Ring Chirurgie (24,3 ± 2,9 g) vor der HU. Auch nicht das Körpergewicht signifikant sofort Rückgang nach 14 Tagen HU (22,7 ± 1,9 g), 28 Tage von HU (21,3 + 2,1 g) oder nach 3 Tagen Erholung von HU (24,0 ± 1,8 g). Obwohl HU für 14 und 28 Tage führte zu einer kleinen (-6,8% bzw. 12%), aber nicht signifikanten Verlust an Körper-Masse, die Mäuse voll auf ihre Vor-HU Körpergewicht nach 3 Tagen der Erholung erholt. Verzehr von Lebensmitteln für die ambulante Kontroll-Mäusen und HU-Mäusen ist in Abbildung 3 dargestellt. Durchschnittliche tägliche Futteraufnahme war nicht anders in HU-Mäuse über 28 Tage im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Wir beobachteten signifikanten soleus Muskelatrophie folgenden HU für 14 und 28 Tagen (-39,1%, -46,6% und), was eine effektive HU-Verfahren (Abb. 2). Des Weiteren wird diese Grad der Atrophie ist konsistent mit der erwarteten Literaturwerte für 2-4 Wochen nach der HU 2, 7, 8. Nach 3-tägiger Erholung von HU soleus Masse deutlich auf 74% der Kontrollwerte. Soleus Masse in die Erholung Gruppe war wesentlich größer als die beiden HU-Gruppen, aber immer noch deutlich weniger als ambulante Kontrolltieren.

Adrenal Gewichte wurden als Indikator für das Tier Stress gemessen; sowohl die linke und rechte Nebenniere wurden ausgeschnitten und gewogen. Die durchschnittliche Gewichte waren vergleichbar für Steuerungs-und HU-Mäusen Mäuse in allen Gruppen (Abbildung 4).

Zuvor bei Ratten haben wir gezeigt, dass die Erfolgsquote für die Anzahl der Tiere zu Beginn der HU, die Zahl der Tiere, die HU ohne Coming Out der Aufhängevorrichtung abgeschlossen (wegen Tieren Kauen durch den Schweif-Traktion Band) verglichen wurde, 10 aus von 12 mit dem Morey-Holton Technik 1. Keine der Mäuse (n = 54) in dieser Studie, die jemals kam aus der Suspension vor der Fertigstellung der HU Zeitraum. Wir haben jedoch einen Maus, die das entwickelte ein stark entzündeter Schwanz. Wenn die Entzündung deutlich wurde, entfernten wir den Schwanz Ring, damit die entzündete Stelle zu heilen, und anschließend platziert anderen tail-Ring, um die Dauer der HU abgeschlossen.

In der Vergangenheit, wenn wir die Morey-Holton Methode der HU verwendet, wir in der Regel beseitigen 1-2 Mäuse / Gruppe, weil sie aus der Aufhängevorrichtung zu kommen. Mit dem Weg-Ring-Verfahren gab es keine Fälle von Mäusen aus Versehen, die aus dem HU Gerät während der HU für 14 oder 28 Tage (n = 54 Mäuse).

Abbildung 1
Abbildung 1. Änderungen des Körpergewichts (Mittelwert ± SD). Abkürzungen: CON: Gewicht tragenden Mäusen der Kontrollgruppe (n = 76); Pre-HU: alle Mäuse vor der HU (n = 54); HU14: Mäuse Hinterlauf für 14 Tage (n = 34) entladen; HU28: Mäuse Hinterlauf für unbelasteten 28 Tage (n = 20); REC: Hinterlauf entladen Mäuse dürfen Käfig für 3 Tage (n = 22) zu erholen. Keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht waren zwischen den Gruppen beobachtet.

Abbildung 2
Abbildung 2. Soleus Muskelatrophie (Mittelwert ± SD). Abkürzungen: CON: Gewicht tragenden Mäusen der Kontrollgruppe (n = 76); HU14: Mäuse Hinterlauf für 14 Tage (n = 34) entladen; HU28: Mäuse Hinterlauf für 28 Tage (n = 20) entladen, und REC: Hinterlauf entladen Mäusen erlaubt zum Käfig für 3 Tage (n = 22) zu erholen. * Signifikanter Unterschied (p <0,001) als tragende Kontrolle (CON). δSignificantly unterschiedlich (p <0,01) als die beiden HU Gruppen.

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Abbildung 3. Verzehrsstudie (Mittelwert ± SD). Durchschnittliche tägliche Futteraufnahme (g / Tag) während Belastung und Hinterlauf Entladen. Abkürzungen: Gewicht tragenden Mäusen der Kontrollgruppe (n = 76); HU: Mäuse Hinterlauf unloaded14 - 28 Tage. Keine signifikanten Unterschiede zwischen den CON-und HU-Gruppen beobachtet.

Abbildung 4
Abbildung 4. Adrenal Mass (Mittelwert ± SD). Abkürzungen: CON: Gewicht tragenden Mäusen der Kontrollgruppe (n = 76); HU14: Mäuse Hinterlauf für 14 Tage (n = 34) entladen; HU28: Mäuse Hinterlauf für 28 Tage (n = 20) entladen, und REC: Hinterlauf entladen Mäusen erlaubt zum Käfig für 3 Tage (n = 22) zu erholen. Wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet.

Discussion

Wir untersuchten eine alternative Methode der Hinterlauf Entladen Mäuse, die wir bestimmt sich als äußerst erfolgreich. Der Schwanz-Ring-Verfahren wie hier beschrieben wurde für die langfristige Hinterlauf Suspension verwendet, und die Recovery nach HU studieren. Unter jeder dieser Bedingungen, es gab keinen Beweis für ein Versagen, sich anzupassen, wie stabil die Nahrungsaufnahme, Körpergewicht und Nebennieren Gewichte der Mäuse nachgewiesen. Dieser Schwanz-Ring HU-Technik ist einfach durchzuführen und können problemlos mit sehr wenig chirurgische Praxis integriert werden.

Es gibt mehrere Vorteile von tail-Ring-Methode im Vergleich zu den traditionellen Morey-Holton 5, 6-Methode. Zunächst werden die Haut und Ring Implantationsstelle an diesem Schwanz immer sichtbar, so dass, wenn Probleme entstehen ist es offensichtlich sofort, nicht erst am Ende der Aussetzung. Zweitens sind die Tiere nicht in der Lage, sich aus der Aufhängevorrichtung zu irgendeinem Zeitpunkt während HU, die Beseitigung der Notwendigkeit, eine Feststellung, ob eine Maus oder nicht im Datensatz behalten zu machen. Darüber hinaus sind die Mäuse nicht die Mühe, den Ring Apparate und, wenn sie von HU für die Verwertung freigegeben werden, sie nicht mit ihren Schwänzen manipulieren, so dass für einen nahtlosen Erholungsphase nach HU. Schließlich halten Hinterlauf entladen Mäuse mit dem Schwanz-Ring-Methode ihr Körpergewicht besser als Mäuse Hinterlauf der Morey-Holton tail-Traktion Technik entladen. In unseren Händen nach 14 Tagen HU beobachteten wir eine kleine (-6,8%), aber nicht signifikanten Verlust an Körper-Masse. Während Ingalls et al. Beobachteten einen signifikanten -12% Abnahme des Körpergewichts bei Mäusen nach 14 Tagen HU durch den Morey-Holton Methode 3. Obwohl Ingalls nicht gemeldet haben Nebennieren Gewichte, scheint es, dass unsere tail-Ring-Methode weniger Stress verleiht der Maus (Nebennieren Gewichte in unseren HU Mäuse sind nicht anders als bei den Kontrollen) und eine bessere Wartung des Körpergewichts während der Hinterlauf Entladen Zeitraum.

Zusammenfassend wurde ein tail-Ring-Methode der Hinterlauf Entladen entwickelt und getestet an Mäusen HU für 14 und 28 Tagen und an Mäusen wieder in Käfig Erholung für 3 Tage nach der HU. Auf der Grundlage der Nebennieren-Gewichte, Körpermasse und Nahrungsaufnahme, erscheinen Mäuse auch an den Schwanz-Ring Apparat angepasst haben. Der Schwanz-Ring Hinterlauf des Entladens ist eine nützliche, einfache Alternative zu den traditionellen Morey-Holton Hinterlauf Entladen Technik.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Andrew J Dunn, eine hervorragende Undergraduate Research Student in unserem Labor, für seine technische Unterstützung und Fürsorge für die Tiere danken. Das National Institute of Health gewähren HD058834 und der University of Missouri Life Sciences Fellowship finanziert diese Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wire cutters/pliers Ace Hardware 84-056
Gauze Fisher Scientific 22-037-901
Heating pad Sunbeam Z-1228-001
Silver nitrate applicators ARZOL 0001-2
Isoflurane,USP Novaplus NDC 0409-3292-49
Chlorhexidine Gluconate 4% Purdue Products L.P. NDC 67618-200-01
Sterile 2-0 surgical steel suture Ethicon Inc. SS-28
25 X 5/8 A gauge needle Terumo Medical Corp. NN 2516R
Hemostat/ needle holder Fine Science Tools 12500-12
Size 10-24 X 4 machine screws Hillman The Fastener Center 90272
Nylon lock nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180141
Wing nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180243
Fender Washer size ¼ X 1 Hillman The Fastener Center 290012
Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” Bass Pro Shop 38-481-554-01
Metal sewing machine bobbin. Singer Instruments 45785
Paper clip Office Depot 221720
2” black paper binder clamps. Office Depot 308957
Scotch Multi-Use Duct Tape Office Depot 790710
1-3/8” Plated slotted steel bar Home Depot 548932 Extends slightly beyond the full length of the cage
50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage Alternative Design Manufacturing RC88D-PC
Water Bottle Alternative Design Manufacturing WB16FS
Stainless Steel wire Small Parts, Inc. SWX-4029 U-shaped wire to support water bottle

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References

  1. Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
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Comments

2 Comments

  1. Is it possible to apply such a method to rat?
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Christian C.
    March 19, 2013 - 12:22 PM
  2. Yes!!
    We have tried this method in both species and have the same results.

    Reply
    Posted by: Johan F.
    March 19, 2013 - 2:48 PM

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