카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 '발광 생물'리포터 파지

Immunology and Infection

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Summary

우선 세균성 병원균의 식별을위한 간단한 방법은 유전자 조작 기자 파지를 사용하는 것입니다. 자신의 특정 호스트 수종와 관련된 이러한 기자의 파지는 빠르게 호스트 세포에 발광 생물 신호 응답을 transducing 수 있습니다. 여기에, 우리는의 검출에 대한 기자의 파지의 사용을 설명

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Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740, doi:10.3791/2740 (2011).

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Abstract

Yersinia pestis의바실러스 anthracis는 각각 1, 역병과 탄저병의 원인이되는 대리인하는 세균성 병원균 카테고리입니다. 두 질환 '의 자연 발생 지금은 비교적 드문이지만, 분류된 생물학 무기 이러한 병원균을 사용하는 테러 집단의 가능성은 현실입니다. 질병의 고유한 communicability, 신속한 임상 과정, 높은 사망률 때문에 그것은 확산이 빠르게 감지하는 것이 중요합니다. 따라서 빠른 감지 및 진단을 제공하는 방법은 공중 보건 조치 및 위기 관리의 활성화의 즉각적인 이행을 보장하기 위해 필수적입니다.

재조합 기자 파지는 Y.의 검색에 대한 신속하고 구체적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다 pestis와 B. anthracis가. 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 현재 이러한 세균 병원균 2-4 확인 식별에 대한 고전적인 파지의 용해 assays를 사용합니다. 이러한 assays는 자연스럽게 자신의 세균 호스트에 대한 구체적이고 lytic 아르 파지를 발생 활용합니다. 특정 파지의 존재에 재배 세균의 하룻밤 성장 후, plaques (세균 용해)의 형성은 박테리아 타겟의 긍정적인 식별을 제공합니다. 이러한 assays는 강력한 있지만, 그들은 세 가지 결점으로 고통 : 1) 그들은 실험실을 기반으로, 2) 그들이 의심되는 시료에서 세균 분리 및 배양을 필요로하고, 3) 그들은 완료하는 데 2​​4-36 H 가져가라. 이러한 문제를 해결하기 위해 재조합 "빛을 태그"기자 파지는 유전자 Y.의 게놈에 장염 harveyi luxAB의 유전자를 통합하여 설계되었습니다 pestis와 B. anthracis 특정 파지 5-8. 그 결과 luxAB 기자의 파지는 빠르게하여 특정 목표를 감지할 수 있었다 (분 이내) 및 sensitively받는 세포에 발광 생물 표현형를 부여. 중요한 것은 감지 재배받는 세포 또는 모의에 감염된 임상 표본 7 중 얻은 것입니다.

데모를 위해, 우리가 알려진 Y.의 파지 - 중재 검출하는 방법을 설명 pestis는 CDC 전염병 진단 파지 ΦA1122 6,7 (그림 1)에서 만들어진 luxAB 기자 파지를 사용하여 분리. 사소한 수정 (성장 온도와 미디어 예 변화)와 유사한 방법, B.의 검색에 사용할 수 있습니다 anthracis은 B.를 사용하여 분리 anthracis 기자의 파지의 Wβ : luxAB 8. 방법은 재배 Y까지 biolumescent 표현형의 파지 - 중재 전달을 설명합니다 이후 microplate의 luminometer를 사용하여 측정 pestis 세포. 전통적인 파지의 용해 assays를 통해이 방법의 주요 장점은 사용, 빠른 결과를, 그리고 96 - 웰 플레이트 microtiter 형식으로 동시에 여러 샘플을 테스트하는 기능의 용이성이다.

그림 1
그림 1. 검색 설계도. 파지를 예제와 함께 혼합되어, 파지는 세포, luxAB가 표현되며, 세포를 감염 bioluminesces. 샘플 처리가 필요하지 않습니다, 파지와 세포가 혼합되고 이후 신호를 측정.

Protocol

1. Y. pestis 플레이트 접종

  1. 리크 Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) Luria - Bertani에 재고 문화 (LB) 한천 (밀러). 무균 기술을 사용하여 모든 Y.을 수행 클래스 II 타입 biosafety 캐비닛. Y. pestis의 조작에 pestis A1122은 BioSafety 수준 (BSL) 2 제외를 선택 에이전트 부담입니다. 그것은 모두 75킬로바이트 쌍은 낮은 칼슘 플라스미드 응답 (LCR) 독성 및 독성에 필요한 PGM의 로커스 부족하다. Y. 그로 28 pestis ° C 공기 배양기를 제어 정적 온도 48 H하십시오. 와이의 성장률 pestis는 H 9 1.25의 세대 시간 느립니다.

2. Y. pestis 액체 미디어 접종

  1. 단일 Y.을 전송 멸균 금속 접종 루프를 사용하여 LB 제품 국물 2 ML을 포함하는 멸균 17 X 100mm 문화 튜브에 pestis 콜로니. 균일한 크기의는 식민지를 선택하고, 다른 식민지는 지표이며, 명확하게 접시에있는 식민지의 나머지 부분에서 분리됩니다. 소용돌이 간략 튜브 28에서 문화를 성장 ° C 떨고 인큐베이터 (225 RPM)에 약 20 H하십시오.

3. Y. pestis의 파생물, 기자 파지 추가하고, 발광 생물 검출

  1. 밤새 Y.을 희석 pestis 문화 50 ML 팔콘 튜브에 신선한 LB의 국물 (예 : 매체의 9.5 ML로 세포 500 μL)로 1시 20분과 ° C (225 RPM) 잡고 28 성장. 0.2 600 NM (600)에서 광학 밀도 (약 5 H)에 도달할 때까지 성장합니다. 적극적으로 성장 세포는 발광 생물 응답 호스트 박테리아의 생존 및 피트니스에 상관이다 transduce로 파지의 능력부터 감지 바람직합니다. 그럼에도 불구하고, 탐지 시스템은 성장주기 7 모든 단계에서 수확 전지와 호환되도록 표시되었습니다.
  2. 2 % N - 지구장의 솔루션을 준비하여 발광 생물 반응에 필요한 기판을 생성합니다. LB의 국물의 9.8 ML과 N - 지구장의 200 μL를 섞습니다. 5 S. 위해 적극적으로 소용돌이 프라임 2퍼센트 N - 지구장의 솔루션 2 ML과 microplate luminometer 주입기. luminometer 잘하고 다음 각 microplate에 지구장의 솔루션을 67 μL를 autoinject 즉시 10 S.에 대한 샘플을 읽을 사전 설정된
  3. 3 문화 튜브에 LB의 국물 1 ML aliquots 하는걸. 각각의 튜브에 기자 파지 주식 솔루션 (5 X 10 9 플라크 형성 단위의 주식 [PFU] / ML) 20 μL를 추가, 파지 및 미디어 혼자 샘플은 부정적인 제어 역할을합니다. 와이의 부재에 pestis 세포는 기자의 파지의 추가는 발광 생물 반응을 이끌어해서는 안됩니다.
  4. Y. 1 ML aliquots 하는걸 6 문화 튜브에 pestis 문화 (단계 3.1에서). 문화 (테스트 문화)의 3 기자 파지 주식 20 μL를 추가합니다. 나머지 세 문화는 '셀 혼자'대조군 (배경 autobioluminescence)로 제공하고 있습니다. 간략 vortexing으로 문화를 믹스하고, 각 샘플에서 수확 200 μL (시간 0 읽기)과 흰색 96 - 웰 플레이트 microtiter로 분배. 28에 남아있는 문화를 품어 ° C를 (225 RPM) 잡고.
  5. microplate의 luminometer를 사용하여 bioluminescence (상대적인 빛의 단위, RLU)에 대한 시간 0 명 샘플을 측정합니다.
  6. 10 일 이후 각 샘플의 수확 200 μL, 20, 30, 40, 50, 그리고 60 분 후 기자 파지 추가하고, bioluminescence에 대한 샘플을 측정합니다. 경우 Y. pestis 세포가 존재, 기자의 파지는 특히 세포에 바인딩의 DNA를 삽입하고, luxAB 기자 유전자 (그림 1)을 녹음하고 번역하는 호스트에게 transcriptional과 translational 기계를 사용합니다.
  7. 신호의 강도와 신호 응답 시간은 현재 세포의 수에 비례합니다. 셀 (10 5 -10 8 CFU / ML), 컨트롤에 비해 RLU에 상당한 증가의 높은 농도에서 20 분 이내에 분명해야합니다. 낮은 세포 농도에서, (10 2 -10 4 CFU / ML), RLU 크게 증가 40-60 분 이내에 분명해야합니다.
  8. 또는, Y. 필요없이 탐지 과정을 진행할 수 있도록 갓 어른이 접시에서 pestis의 파생물, 식민지 직접 기자의 파지를 숨겨주 LB의 국물 200 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 (vortexing으로) 혼합 수 있습니다. microtiter 접시에 잘으로 셀 / 파지 혼합 분배. 28 ° C에서 microtiter 접시를 부화하고 60 분 (단일 시점 전용) 이후 bioluminescence에 대한 샘플을 참조하십시오.

4. 대표 결과 :

기자 파지의 대표적인 시간 코스 실험 Y.의 검색을 중재 pestis는 그림 2에 그려져 있습니다. 1의 부정적인 컨트롤) 파지 혼자 (NO 세포), 또는 혼자서 2) 전지 (NO 파지) 60 분 병원 전반에 걸쳐 약 20 RLU의 bioluminescence의 기본 수준을 제공합니다ubation (기준 레벨 luminometer의 특정됩니다.) 대조적으로, 테스트 샘플 (기자의 파지 및 세포)에 대한 bioluminescence의 증가 파지 추가 후 15 분 분명하다. 신호 강도는 60 분 이상 꾸준히 증가한다. 연장 기간 (80 분)에 대한 Incubations는 호스트 세포의 중재 용해를 파지에 의한 피크 신호​​로부터 거부하는 신호가 발생합니다. 비슷한 결과는 37 배양 온도를 얻을 수있다 ° C에도 Y.을위한 최적 온도 pestis 성장 28 ° C 9.

그림 2
그림 2. 와이의 파지 - 중재 발광 생물 검출 pestis. 시간이 0, 기자의 파지와 세포가 28 ° C에서 incubated, 혼합되었고, bioluminescence가 (RLU) 시간이 지남에 모니터됨. RLU 크게 증가 (* 학생 T - 테스트, P <0.05) 15 분 이내에 분명하다.

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Discussion

이 방법은 빠르게 Y.을 감지하기 위해 기자 파지의 능력을 보여줍니다 기자 파지 이후 pestis는 교양 Y까지 발광 생물 신호 응답을 transduce 수 파지 추가 후 20 분 이내에 pestis 세포. 기자 파지도 직접 Y. 검출이 가능합니다 절연 이후 재배 7 전제 조건없이 임상 매트릭스에 pestis. 일반적으로 완료 48 H를 필요로하는 표준 파지의 용해 assays에 비해, 이것은 크게 검색 시간을 감소시킵니다.

이전 연구는 야생 형 ΦA1122의 파지는 거의 모든 천연 Y.을 lyse 수있는 증명 pestis는 격리하고, Y.에 대해 '구체적인'입니다 pestis 6,10,11 있지만, 일부 Y. pseudotuberculosis의 변종은 20 ° C 이상의 온도에서 6,10,12 성장하면 ΦA1122 감염될 수 표시되었습니다. 온도에 민감한 차동 자화율에 대한 이유는 알 수 있지만, 세포 표면 레이어 / 조성에서 온도 변화에 의존 아마도 때문에. 따라서 기자 파지 탐지 시스템의 잠재적인 주의해야 할 점은 밀접하게 관련 종 Y.에서 종자와 거짓 - 긍정적인 반응의 가능성 pseudotuberculosis. 제한 온도 (20 ° C)에서 기자 파지 분석을 수행하면 Y.을 포함할 수 있습니다 샘플에 잘못된 긍정적인 신호를 방지할 수 있습니다 pseudotuberculosis. 특정 온도에서 성장 고립된 문화를 사용하는 경우 따라서 특이성이 엄격하게 제어할 수 있습니다.

요약, 빠른 감지 및 진단에 pestis는 전염병 이후 긍정적인 예후 (豫后), 특히 호흡기 전염병에 대한 필수적인 치료가 증상 발병 후 첫 24 H 내에 실시하지 않은 경우 거의 항상 치명적이다. 이 방법은 교양 격리의 확인 식별 또는 임상 관련 매트릭스 내에서 이러한 요구를 충족시킬 잠재력이있다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 보건원의 중소 기업 혁신 연구 프로그램 (NIAID, 1R43AI082698 - 01)과 식량 농업의 국립 연구소 USDA (NIFA, 2009-33610-20028)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco LB agar, Miller VWR international 90003-346
Difco LB broth, Miller VWR international 90003-350
17 x 100 mm culture tubes USA Scientific, Inc. 1485-0810
n-Decanal Sigma-Aldrich D7384
Veritas microplate luminometer Turner Biosystems 9100-001
Microlite microtiter 96-well plate VWR international 62402-984

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References

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