랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

Neuroscience
 

Summary

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을 감소

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Jin, Z., Jin, Y., Birnir, B. GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices. J. Vis. Exp. (53), e2858, doi:10.3791/2858 (2011).

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Abstract

GABA 채널은 모든 뉴런에 존재하고 그들이 4,5,6,7 GABA 채널 pentameric GABA - 게이 티드 염화물 채널입니다 각각 phasic와 토닉 전류를 생성하는 위치를 모두 시냅스의 시냅스와 외부에 위치하고 있습니다. 채널 subunits는 8 가족 (α1 - 6, β1 - 3, γ1 - 3, δ, ε, θ, π와 ρ)로 분류됩니다. 두 알파, 두 베타 한 제 3의 subunit의 기능 채널 8을 형성. GABA의 모든 인구가 신경 세포의 채널을 포함하여 연구와 하위 유형의 특정 GABA 활성화된 단일 채널 분자의 연구를 결합하여 그것은 기본의 연결 억제의 메커니즘과 방법은 약리 에이전트에 의해 변조된을 이해하는 것이 가능하게됩니다.

우리는 hippocampal 뇌 조각의 살아있는 뉴런에서 GABA 채널의 기능적 특성을 연구하고 단일 채널 및 전체 세포 전류를 기록하기 위해 패치 - 클램프 기법 9,10를 사용합니다. 우리는 더 이상 채널이 다른 GABA 농도, 다른 마약과 내부 및 세포외 요인에 의해 영향을받는 방법을 확인합니다. 패치 - 클램프 방법의 상세한 이론 및 실용적인 설명을 보려면 B Sakman 및 E Neher 10 편집 단일 채널 레코딩을 참조하시기 바랍니다.

Protocol

1. 뇌 조각의 준비 :

22일 이전 위스타 쥐 - 실험은 출생 후의 16 hippocampal 뇌 조각에서 수행됩니다.

  1. 동물은 지역 윤리 지침과 승인된 동물 관리 프로토콜에 따라 잘린에 의해 희생되었습니다.
  2. 빠르게 주걱으로 두뇌를 제거하고 수술 블레이드 (# 24)과 정중선을 따라 잘라. 신문을 직면하고있는 상처와 왓먼 필터 종이에 각 반구를 놓으십시오.
  3. 표본 디스크에 superglue 한 방울을 넣고 컷 표면이 아래로 향하게로 위에 반구를 놓으십시오. 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수으로 가득합니다 vibratome의 커팅 챔버의 표본 디스크 플레이스 (ACSF을 아래에 3.1을 참조하십시오).
  4. 400 μm의로 슬라이스의 두께를 설정하고 두뇌를 절단 시작합니다. 당신은 해마에 도달하기 전에 뇌 조직의 약 2mm를 잘라해야합니다.
  5. hippocampal 조각은 ACSF 가득한 유리 페트리 접시에 넣어 수 있습니다. 접시는 hippocampi 쉽게 시각화 수 있도록 검정색 배경 (예 : 검은 종이)에 배치됩니다. 날카로운 수술용 블레이드를 사용하여 주변 조직에서 해마를 분리. 조직을 밀고 당기거나하지 않도록주의하십시오.
  6. 슬라이스는 다음 상온에서 저장 후 ° 1H위한 C와이 실험까지 완료 37.0에서 ACSF 솔루션 incubated 수 있습니다. 한 시간 동안 배양 조직은 가공 과정에 의해 부과된 손상으로부터 복구합니다.

2. 패치에 대한 pipettes의 준비 :

  1. Pipettes은 borosilicate 유리 모세관에서 만들어집니다.
  2. 패치 - pipettes은 pipettes의 결과로 자동 또는 수동 피펫 pullers에 행진 2 저항 - 전체 셀 레코딩을위한 MΩ 4 8 - 단일 채널 녹음에 대한 MΩ 20 적절한 피펫 솔루션과 ACSF되는 목욕 솔루션으로 가득 (3.1, 아래 참조).
  3. 우리가 단일 채널 녹음에 사용 pipettes은 백금 와이어에 앉아 녹은 유리의 열기가 표면이 매끄러운 만드는 microforge를 사용하여 연마하고 있습니다. 같은 borosilicate 유리로 패치 - pipettes에있는 철사에 유리 비말을 형성하는 데 사용됩니다. 우리의 경험에 pipettes이 방법을 연마하는 것은 uncoated 와이어에서 열 또는 자동 풀러의 연마 단계에서 광택 pipettes에 비해보다 안정적이고 높은 저항 물개를 형성 pipettes를 만듭니다. pipettes의 최종 크기는 8 일부터 20 MΩ 범위. 전체 셀 녹음에 사용 Pipettes이 연마되지 않습니다.

3. 실험에 사용되는 솔루션 :

특정 솔루션은 단일 채널 및 전체 셀 레코딩에 사용됩니다.

  1. ACSF이 MM에 포함되어 있습니다 : 124 NaCl, 26 NaHCO 3, KCl, 1.3 MgSO 4, 2.5 나 2 HPO 4, 2.5 CaCl 2, 산도 7.2 10 포도당 - 7.4 95% O 2 5% CO 2와 함께 부풀어 오른 경우. ACSF 때때로 또한 예를 들어, 락트 산 11과 같은 다른 영양소와 보충합니다.
  2. 단일 채널 녹음 : 목욕 솔루션은 ACSF 또는 MM의 하나입니다 : 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2 10 TES (N - 트리스 [히드록시 메틸] 메틸 - 2 - aminoethanesulfonic 산성) 산도 7.25 및 기타 약물 그것은 특정 실험에 필요한 수 있습니다 MM의 세포 부착 및 내부 아웃 패치 피펫 솔루션 :. 140 콜린 Club 호텔 5 NaCl, 1 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 10 TES 산도 7.25, 200 μm의 saclofen (GABAB 길항제)와 0-1 μm의 GABA. 밖에서 아웃 MM에 패치 : 140 NaCl이나 콜린 Club 호텔, 0.3 KCl, 2 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES의 산도 7.2-7.4.
  3. 전체 셀 전압 클램프 녹음 : 목욕 솔루션 :. 슬라이스가 (2-3 ML / 분) perfused 아르 ACSF 지금도 kynurenic 산성 (3 ㎜)와 구체적인 실험에 필요한있을 수있는 다른 약물을 포함하는있는 피펫 솔루션이 포함되어 있습니다 MM의 : 140 CsCl, 1 CaCl 2, 3 EGTA, 0.5 KCl, 1 MgCl 2, 2 ATP - MG, 0.3 GTP - 나, 5 QX - 314, 브로마이드, CsOH과 7.25 10 TES의 산도.

4. 패치 - 클램프 실험 기가 옴 (GΩ) 인감을 형성 :

hippocampal 뇌 조각 (그림 1A)은 U 모양의 백금 선에 나일론 스레드에 의해 녹음 챔버의 하단에 개최됩니다. CA1 3 예 조직 조직과 hippocampal 조각이나 특정 세포에있는 이가있는 이랑 영역을 시각화하기 위해서는 현미경이 필요합니다. 대부분의 실험실 따라서 하나가 조직의 지역이나 특정 세포를 식별할 수 있도록하기 위해 60X 10X까지 목표와 수직 현미경을 사용합니다. 그러나, 패치 조각에도 해부 현미경을 사용할 수 있습니다 그리고 당신은 시각적으로 특정 세포 아니라 패치 영역을 식별하지만. 패치 이런 종류의는 "장님 패치"를 칭했다입니다. 나N 두 경우 모두 최종적으로 하나는 패치는 특정 지역에서 단일 세포이다. 성공률은 두 가지 방법에 대해 비슷합니다. 해마의 주요 세포의 세포 기관이 해마의 모든 subfields과​​ 지층 사이에 흩어져있는 고도로 구조화된 라미나 (예 : CA3/CA1 지층 pyramidale과 hippocampal 뇌 통에 밝은 밴드로 식별)로 구성되어 있지만 억제의 세포 기관 아르 전체 인구의 연결을 12 10 %를 만들어 interneurons. 과립 세포 또는 피라미드의 연결 라미나에 패치가있을 수 있습니다 가끔 interneuron 또는 glia는 이러한 세포의 서로 다른 전기적 특성 (해마 도서 13 참조)하여 주요 세포에서 차별화된 수 있습니다.

  1. GΩ 시일 형성. 이 절차를 수행하는 동안 유리 피펫 어떻게든 단단히 세포 막에 붙어 다른 패치 구성에서 우리가 세포막에있는 GABA 활성화된 채널의 활동을 측정할 수 (4, 5, 아래 참조)가됩니다.
    피펫 홀더에 피펫을 넣고 피펫을 fastens 뚜껑을 조입니다. Axoclamp 증폭기 200B에 대한 설정은 다음과 같습니다 V - 클램프, 게인 2, 필터 2 kHz에서, 개최 가능성은 0 MV이며 우리는 PClamp 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터를 통해 실험을하고 있습니다.
  2. 피펫 홀더에 연결하고 마우스 피스와 튜브 사이의 밸브를 닫습니다 튜브에 연결된 마우스 피스에 불어. 이것은 피펫에 긍정적인 압력을 만듭니다. 피펫의 긍정적인 압력이 두 가지 기능을 가지고, 처음 스트림은 피펫 나올 것이며 한번 피펫은 피펫 팁 깨끗하게 유지하는 데 도움이 될 목욕 솔루션을갑니다. 둘째, 패치 - 피펫을 통해 세포막에 부드러운 흡입을 적용하면 높은 품질, 높은 저항 인감 형성의 중요한 부분입니다. 인감은 종종 단순히 피펫 압력을 제어하는​​ 밸브를 열어 형성 수 있습니다. 이 때문에, 공기 누출이 없습니다 있는지 확인하십시오. 당신은 쉽게 피펫으로 홀더를 취하여 누출을 테스트할 수, 마우스 피스에 물 불어 가득한 비커에 그것을 찍어. 어떤 거품이 탈출 표시면 그 부분은 충분히 꽉하지 않습니다.
  3. 목욕 솔루션에 피펫을 줄일 수 있습니다. 당신이 피펫의 저항을 측정 컴퓨터 화면에 당신이 5 MV 펄스 열차와 귀하의 피펫의 저항을 알려주는 숫자에 의해 생성된 사각형 펄스를 볼 수 있습니다. 작은 숫자가 큰 피펫 팁 채용, 큰 pipettes를 나타냅니다. 0 오프셋 피펫을 조정합니다.
  4. 세포막에 씰링. 에 도장을 형성하는 지역 또는 패치로 가고있는 세포를 식별합니다. 뇌 슬라이스 내에서 하나는 이가있는 이랑의 과립이나 현미경에서 10X 배율을 사용하여 밝은 밴드로 해마의 CA1과 CA3 피라미드 세포 신체 영역 (그림. 1A 참조) 식별하거나 우리를 사용하여 각각의 표면 피라미드 뉴런을 식별할 수 있습니다 60X 확대.
    1. 당신이 현미경 눈을 조각 들여다 때 지역 / 세포와 피펫을 모두 볼 수 있도록 초점에 피펫을 가져와.
    2. 그냥 위에 있지만 조직을 만질 때까지 거친 - 동작 조작하는 사람 설정과 낮은 피펫을 사용하여 지역 / 세포의 중앙 위에 피펫를 놓습니다.
    3. 아주 부드럽게하여 조작하는 사람에 미세 동작 설정을 사용하여 지역 / 세포의 중간에 귀하의 피펫을 절감하고 동시에 컴퓨터 화면을 시청하고 피펫 저항을 추적할. 당신이 피펫의 저항이 큰되기 (높은 숫자)를 참조하십시오 때까지 피펫을 계속.
    4. 이제 부드럽게 밸브를 개방하여 피펫에 긍정적인 압력을 릴리스합니다. 부드러운 흡입하고 종종 기가 - 인감 (높은 저항 인감, GΩ)가 automatically.If하지 양식이 금액은 다음 이전에 긍정적인 압력과 기가 - 시일이 양식을 것입니다 적용된 마우스 피스에 흡입을 적용합니다.
    5. 이제 소위 전지에 연결된 패치 - 클램프 구성을 (그림을 참조하십시오. 1B)를 취득했습니다. 피펫 및 피펫 홀더에서 오는 과도를 취소할 수있는 빠르고 느린 커패시턴스 보상을 조정하십시오. 컴퓨터 화면에 지금은 평면 현재 흔적을 볼 수 있습니다. 높을수록 GΩ 시일 가치, 더 나은 신호 대 잡음 비율은 당신이 단일 채널 녹음에 필요하게됩니다.

그것은 때로는 hippocampal 슬라이스 내에 패치에 유리하실 수 있습니다. 어떤 경우에는 세포가 건강 표면에 그들이 더 보호하지 때와 수 있습니다. 또한, 경우에 한 등 조직 내의 뉴런, 패치에 토닉 현재 세대에서 세포외 GABA 농도의 효과로, 세포 기능의 세포외 환경의 영향을 공부하는 것은 장점 수 있습니다. 패치 절차 그 하나에서 떨어져 위에서 설명한 것과 같은 것은 PO를 공개하지 않습니다피펫의 sitive 압력은 피펫 팁까지 슬라이스 내에 있습니다.

5. 전체 셀 구성 및 기록 전체 셀 전류를 구축 :

  1. 세포 연결된 구성에서 -60 MV에 피펫 잠재력을 변경하거나 세포의 휴식 막 잠재력을 닫습니다.
  2. 피펫 홀더에 연결함과 동시에 저항하고 셀에 고장되면 나타나는 커패시턴스 과도의 변화를 확인하려면 컴퓨터 화면을 볼 수있는 튜브를 통해 피펫으로 흡입을 적용합니다. 이것은 소위 전체 셀 구성이나 전체 셀 모드 (그림의 1B)에 발생하는 경우.
    세포막 저항 하나의 셀 타입에서 다른 다양하고 막의 채널과 얼마나 많은 아르 개방의 전도성에 따라 달라집니다. 세포막의 용량은 세포의 크기에 따라 다릅니다. 흡입 처음 부드럽게해야하지만, 그것은 세포보다 강제로 침입하기 어려운 경우에는 적용할 수 있습니다. 흡입의 펄스도 사용할 수 있습니다.
  3. 때로는 피펫과 세포 사이에 개발 저항 보상이 필요합니다. 이 시리즈 또는 액세스 저항 (RS 또는 RA) 보상이라고하며 앰프의 컨트롤 노브를 사용하여 소프트웨어 또는 수동으로를 통해 어느 할 수 있습니다. 우리 실험에서 우리는 라스 보상 모르지만 그것이 초기 접속 저항 이상의 25 % 차이가있다면 실험은 거부됩니다.
  4. 전체 셀 모드에서 기록된 GABA - 활성화 토닉 전류.

전체 셀 구성에서 hippocampal CA1 피라미드 뉴런에서 우리는에서 가지고 잠재 세트 - 60 MV하고 5 기다려 - 피펫 솔루션은 세포 내부와 평형 수 있도록 10 분. 이 시간 동안 녹음이 안정된다. 실험이 진행되는 동안 우리는 직렬 저항의 가치를 추적할.

실험은 전압 클램프로 이루어 그리고 모든 세포 막의 채널의 인구​​를 통해 전류를 측정하고 있습니다. 하나는 전류 phasic와 토닉 자연 GABA 활성화 시냅스와 extrasynaptic 전류 구별할 수 있습니다. 길항제 SR95531는 GABA 전류를 억제. 들고 현재의 감소는 신경 세포의 현재 GABA 활성화된 토닉 수준을 나타냅니다.

우리가 슬라이스에있는 세포, 주위 GABA에 따라 달라집니다 토닉 GABA 활성화된 현재에 관심을 마찬가지로 우리는 일반적으로 표면에 세포를 패치 아니라, 슬라이스 내의 세포하지 마십시오. 우리가 사용하는 Agonists 및 antagonists는 채널 욕조 솔루션에 적용되는 GABA를 조절하고 슬라이스 내의 세포를 도달 않습니다. 3 ML / 분 - 실험 챔버의 솔루션 흐름의 속도는 2입니다.

6. 녹음 단일 채널 전류 :

실험은 세포에 연결된, 내부 출력 또는 외부 출력 패치 - 클램프 구성 완료 (아래 여기를 참조하시기 바랍니다) 및 단일 채널 분자를 통해 우리는 기록 전류, 단일 채널 전류. Axoclamp 200B, V - 클램프, 이득 500 필터 2 또는 5 kHz에서에 대한 설정. PClamp 소프트웨어 우리는 피펫의 가능성을 제어 이하 100 개 μs의 데이터 샘플링 속도를 설정하고 전류를 기록합니다. 그냥 슬라이스를 다루고 있도록 단일 채널 녹음의 소음을 최소화하기 위해 목욕 솔루션의 볼륨 낮게 유지됩니다.

  1. 셀 연결된 구성에서 GABA - 활성화 채널. 당신이 휴대 첨부된 모드에서 막에 GΩ 인감을 취득하고 (그림을 참조하십시오. 1B) 피펫으로 둘러싸인 막 패치에있는 채널에서 녹화할 수 있습니다 때. GABA가 세포막을 통과하지 않으므로, GABA는 패치에 채널을 활성화하기 위해 피펫 솔루션으로 들어가게된다. Extrasynaptic GABA - 활성화된 채널 몇 분 정도의 지연 시간과 활성화합니다. PClamp 여러분이에서 잠재력을 설정 피펫 잠재력의 예 - - 패치 잠재력이있다 = 40 뮤직 비디오, 그것은 depolarized 40 뮤직 비디오로 막에 의해 기록됩니다.
    세포 연결된 모드에서 레코딩의 장점은 채널의 기본 환경에 있고 정상적인 세포 단백질과 요소와 관련있다는 것입니다. 단점은 여러분이 패치를 통해 절대적인 휴식 막 잠재력과 가능성을 모르는대로 정확히 녹음 어떤 가능성에 모른다는 모두 피펫의 잠재력과 세포의 휴식 막 잠재력에 의해 결정됩니다.
  2. 내부 - 아웃 구성에서 GABA - 활성화 채널. 세포 연결된 모드에서 부드럽게하여 피펫을 채취해서 micromanipulators의 좋은 움직임을 사용하여 슬라이스 떨어져 측면과 그것을 이동할 때. 이제 내부 아웃 패치를하고 내부 출력 모드로 녹화할 수 있습니다.
    당신은 (그림을 참조하십시오. 1B)하여 피펫으로 묶여 막의 패치에서 기록합니다. 세포 연결된 모드로채널을 활성화하기 위해 피펫 솔루션에 GABA있다. 그러나, 그러한 benzodiazepines, barbiturates, propofol 등 지질 이중층을 통과 약물들은 피펫으로 건너 수로 목욕 솔루션에 적용하고 채널을 조절 할 수있다 [14]. 패치 가능성 = - 피펫 잠재력과 세포 연결된 모드에서와 같이 중첩도 쉬고 막 가능성이 없기 때문에, 패치 잠재력 - 피펫 잠재 예 같다 그러면 -40 뮤직 비디오 패치를 PClamp의 개최 가능성을 설정하는 경우 잠재력은 정확히 40 뮤직 비디오입니다.
    내부 아웃 구성의 장점은 채널의 속성에 영향을 미치는 경우 그 중 하나가 내부 막 표면에 약물이나 효소를 적용하고 검토 수있다는 것입니다. 내부 아웃 패치를 만드는 힘은 외부 아웃 패치가 형성되었을 때보다 채널 복잡한이 찢어진 - 오프 패치 구성의 형성 가능성이 더 부드러운하는 채널의 멤브레인 환경에 적용되지 않습니다 (아래 참조) .
  3. 외부 출력 구성에서 GABA - 활성화 채널. 전체 셀 모드에서 부드럽게하여 micromanipulator의 좋은 움직임을 사용하여 피펫을 올려하거나 다시 그릴 때. 동시에 패치 등록 정보를 표시하는 컴퓨터에서 창을 봐. 당신은 멀리 세포에서 피펫을하고 싶다면 당신은 커패시턴스 과도이 사라 볼 수 있으며 다시 GΩ 인감을 것입니다. 이제 외부 아웃 패치를 형성하고 외부 출력 모드로 녹화할 수 있습니다.
    아무 래도 세포막은 피펫의 끝에 오픈을 통해 봉인 있으며, 멤브레인 안쪽은 피펫의 인테리어와 멤브레인 (그림의 1B) 녹화 실로 얼굴의 원래 외부에 직면해있다. 검사하는 GABA 및 기타 약물 이제 목욕 솔루션에 녹아 있습니다. 당신이 40 뮤직 비디오에 PClamp에서 개최 가능성을 설정하면 패치 잠재 = 피펫 가능성 단지 전체 셀 모드 예처럼 다음 패치 가능성이 정확히 40 뮤직 비디오입니다.
    외부 출력 모드의 장점은 당신이 막 잠재력이 무엇이고 멤브레인 원래 밖에서 얼굴로 실험 챔버, 사용되는 약물은 목욕 솔루션에 녹아 쉽게 적용하고 채널을 씻어 수있는 정확하게 알고있다. 단점은 멤브레인가 오버 봉인했고 어떤 분자가 손실되었을 수도 있습니다 또는 현지 멤브레인 환경에서 변형된로 더 이상 채널 세포, 심지어 transmembrane 단백질 및 전체 채널 기능에 필요한 수 요인에 첨부하지 않았 수 아르 처리합니다. 그러나, 함께 다른 패치 구성 다른 방법으로 오늘날 불가능 분자 수준에서 채널 속성의 절개를 허용합니다.

7. 결과를 분석 :

단일 채널 및 전체 셀 전류는 PClamp 소프트웨어로 분석됩니다. 우리가 Synaptosoft (GA, 미국) 또는 AXOGraph을 (시드니, 호주)를 사용하여 시냅스 사건의 분석을 위해.

8. 대표 결과 :

그림. 2A는 이가있는 이랑의 과립 신경 세포에서 세포에 연결된 패치 20 NM GABA 농도를 활성화 단일 채널 전류를 보여줍니다. 채널 최대한의 전도성의 활성화의 지연 시간은 2 분 38초되었으며 최대한의 전도성은 PS 15 44되었다. 패치 40 MV에 의해 depolarized했다. 그림. 2B는 토닉 및 phasic 전류를 identifiying 쥐 hippocampal 뉴런에서 전체 셀 전압 - 전류 클램프 레코드의 예입니다. GABAA 길항제 SR95531은 억제 모두 extrasynaptic - (토닉)과 시냅스 생성 (phasic) GABA - 활성 전류. 우리는 (BA) 이가있는 이랑 신경 세포와 (BB) 인슐린은 extrasynaptic 채널 (BA, B) 및 차단 SR95531에 의해 유도된 기준 전류의 변화에​​ 의해 현재 토닉을 드러내는 CA1 피라미드 신경 세포를 치료하는 GABAA 길항제 SR95531 (100 μm의)을 적용 시냅스 전류의 실종 때 SR95531 차단 시냅스 채널 (BB). 기초 조건 CA1 피라미드 뉴런은 뉴런이 4 GABA - 활성화 토닉 전류가 개발 인슐린의 생리적 농도에 노출된 경우 6 토닉 GABA 활성화 전류를 가지고 있지만하지 않습니다.

그림 1
그림 1A. 랫 hippocampal 뇌 슬라이스, 식별 지역 CA1과 CA3 피라미드 세포 레이어와 이가있는 이랑 (DG) 과립 세포 계층입니다. B. 도식 패치 - 클램프 구성.

그림 2
쥐 hippocampal 뇌 통에 이가있는 이랑의 과립 세포에서 세포에 연결된 패치에 GABA 20 NM 활성화 그림 2A가. 단일 채널 전류. 개최 잠재력은 depolarized 40 MV (피펫의 잠재력 = -40 MV)되었습니다. 별표 (* 1 현재 추적) 전류가 더 빠른 시간 척도 (2에 표시된 곳에서 식별ND 현재 추적)이 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 전압 클램프 모드에서 A. 이가있는 이랑의 과립 세포와 B CA1 피라미드의 신경 세포에 쥐 hippocampal 뇌 슬라이스에 기록. B. 전체 셀 전류에서 찍은. 전류가 기록되기 전에 CA1 실험, 조각은 상온에서 2 H 1 NM의 인슐린에 incubated했다.

Discussion

전체 셀 전류는 세포의 활성 채널에 의해 생성된 전류의 앙상블을 나타냅니다. 특정 약리학과 GABAA 채널의 염화물 침투성이 채널과 연관된 전류를 식별하는 것이 가능합니다. 시냅스 채널과 extrasynaptic 채널 토닉 활성화의 활성화의 과도 특성은 신경 세포로 표현 GABAA 채널이 두 인구 사이에 쉽게 차별화 수 있습니다. 단, 단일 채널 녹음이 하나는 토닉 전류를 생성하는 채널 분자의 운동 특성을 공부할 수 있습니다. 100 μs 이내에 활성화 시냅스 채널 달리 토닉 GABAA 채널 GABA는 4,7,15,16,17,18을 적용하는 시간에서 분 범위에서 대기로 활성화됩니다. 많은 채널 등록 정보의 채널이 결과의 지연 활성화는 전체 세포 녹음을 사용하여 공부하실 수 없습니다. 단일 채널 수준에서 GABAA 채널의 다른 하위 인구는 기능성과 약리 특성을 변화에 따라 확인할 수 있습니다. 따라서, 다른 패치 - 클램프 구성 제공하는 것을 활용하여, 그것은 상세히 뉴런에있는 토닉과 시냅스 전류를 생성하는 GABA 활성화된 채널의 분자 기능과 약리학을 공부하는 것이 가능합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 스웨덴 연구위원회, 웁살라 대학과 프레드릭와 잉그리드 Thurings 재단에 의해 투자되었다. ZJ는 EXODIAB 및 Svenska Sällskapet에 대한 Medicinsk Forskning에서 박사 후 교제를 개최. 우리는 기술 지원을위한 프랭크 리 주셔서 감사합니다.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany)

Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

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References

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