GABA تنشيط التيارات قناة واحدة وتونيك في شرائح الدماغ الجرذ

Neuroscience
 

Summary

نستخدم تقنية التصحيح ، المشبك لقياس GABA تنشيط المفرد قناة التيارات (GABAA القنوات ، المستقبلات GABAA) والتيارات متشابك ومنشط التي تولدها في الخلايا العصبية. تفعيل قنوات إنقاص استثارة الخلايا العصبية في الصحة والمرض

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jin, Z., Jin, Y., Birnir, B. GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices. J. Vis. Exp. (53), e2858, doi:10.3791/2858 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وGABA A قنوات موجودة في جميع الخلايا العصبية وتوجد في كل من نقاط الاشتباك العصبي وخارج نقاط الاشتباك العصبي ، حيث أنها تولد تيارات طوري ومنشط ، على التوالي 4،5،6،7 A GABA والقناة هي القناة pentameric كلوريد GABA بوابات. يتم تجميع مفارز قناة إلى 8 أسرة (α1 - 6 ، β1 - 3 ، γ1 - 3 ، δ ، ε ، θ ، وπ ρ). alphas اثنين ، الجيدات مرتين والثالثة 3 الوحيدات شكل القناة وظيفية 8. من خلال الجمع بين الدراسات الفرعية نوع محدد الجزيئات على قناة واحدة مع GABA تنشيط الدراسات بما في ذلك جميع سكان GABA A قنوات في الخلايا العصبية يصبح من الممكن فهم الآلية الأساسية لتثبيط الخلايا العصبية وكيف هو منظم من قبل وكلاء الدوائية.

نستخدم تقنية التصحيح ، المشبك 9،10 لدراسة الخصائص الفنية للقنوات وغابا في الخلايا العصبية على قيد الحياة في شرائح الدماغ الحصين وتسجيل قناة واحدة والتيارات خلية كاملة. علينا مواصلة دراسة كيفية تأثر قنوات مختلفة من تركيزات GABA ، والمخدرات ، وعوامل أخرى داخل وخارج الخلية. وصف تفصيلي للالنظري والعملي للطريقة التصحيح ، يرجى الاطلاع على المشبك واحدة القناة تسجيلات تاليف Sakman B و E Neher 10.

Protocol

1. إعداد شرائح الدماغ :

وأجريت تجارب على شرائح الدماغ الحصين من بعدها 16-22 يوما من العمر فئران ويستار.

  1. يتم التضحية الحيوانات قطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية وافقت بروتوكولات الرعاية الحيوانية.
  2. إزالة بسرعة الدماغ مع ملعقة وقطع عليه على طول خط الوسط مع شفرة جراحية (# 24). كل مكان في نصف الكرة على ورقة تصفية Whatman مع خفض تواجه الورق.
  3. وضع قطرة من superglue على القرص العينة ومكان في نصف الكرة على رأس السطح مع خفض أسفل. ضع القرص العينة في غرفة قطع من vibratome التي هي شغلها مع السائل النخاعي الجليد الباردة الاصطناعي (ACSF ، الرجاء راجع هنا أدناه 3.1).
  4. تعيين سمك شريحة إلى 400 ميكرومتر والبدء في قطع الدماغ. سوف تحتاج لقطع حوالي 2 ملم من أنسجة المخ قبل أن تصل إلى قرن آمون.
  5. توضع شرائح قرن آمون في طبق بتري زجاجية مملوءة ACSF. يتم وضع لوحة على خلفية سوداء (ورقة سوداء على سبيل المثال) للسماح التصور سهل للالحصين. عزل الحصين من الأنسجة المحيطة به شفرات جراحية حادة. يجب الحرص على عدم دفع أو سحب الأنسجة.
  6. ثم يتم تحضين شرائح في حل ACSF على 37.0 درجة مئوية لمدة 1H ومن ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تتم التجارب. خلال ساعة واحدة حضانة النسيج تتعافى من الاضرار التي تفرضها عملية القطع.

2. ماصات لإعداد التصحيح :

  1. مصنوعة من الزجاج البورسليكات ماصات من الشعيرات الدموية.
  2. يتم سحب التصحيح ، ماصات على جر ماصة الآلي أو اليدوي مما أدى إلى مقاومة ماصات 2-4 MΩ للتسجيلات خلية كاملة أو 8-20 MΩ لقناة واحدة عندما التسجيلات مليئة الحل المناسب ماصة والحل هو حمام ACSF (انظر أدناه ، 3.1).
  3. ومصقول وماصات نستخدمها لقناة واحدة باستخدام التسجيلات microforge حيث الحرارة من الزجاج المذاب الجلوس على السلك البلاتين يجعل سطح سلاسة. الزجاج البورسليكات نفسه كما هو في التصحيح ، ماصات يستخدم لتشكيل الزجاج الحبرية على السلك. تلميع ماصات بهذه الطريقة في تجربتنا يخلق ماصات الاختام التي تشكل المقاومة أكثر استقرارا وأعلى بالمقارنة مع ماصات مصقول بواسطة الحرارة من سلك غير المصقول أو خطوة في تلميع مجتذب الآلي. الحجم النهائي للماصات يتراوح 8-20 MΩ. لا مصقول الماصات المستخدمة في خلية كاملة التسجيلات.

3. الحلول التي استخدمت في التجارب :

وتستخدم حلول محددة لقناة واحدة وتسجيلات خلية كاملة.

  1. ACSF يحتوي في ملي : 124 كلوريد الصوديوم ، 26 NaHCO 3 ، 3 بوكل ، 1.3 MgSO 4 ، 2،5 نا 2 هبو 4 ، 2.5 CaCl 2 ، 10 درجة الحموضة مع الجلوكوز 7،2-7،4 عندما انفجر مع 95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO 2. وأحيانا ACSF تستكمل أيضا مع المواد المغذية الأخرى مثل اللاكتات 11 على سبيل المثال.
  2. تسجيلات قناة واحدة : الحل هو إما ACSF الحمام أو في ملي : 140 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 2 و 1،8 CaCl TES 10 (N - تريس [hydroxymethyl] الميثيل - 2 - aminoethanesulfonic حامض) 7.25 درجة الحموضة وغيرها من المخدرات قد تكون هناك حاجة إلى أن لتجارب معينة والحل ماصة للبقع الخلية المرفقة والداخل الى الخارج في مم : 140 الكلورين الكولين ، 5 كلوريد الصوديوم ، 1 بوكل ، 1 MgCl 2 و 1.8 CaCl 2 ، 10 TES 7.25 درجة الحموضة ، و 200 ميكرومتر saclofen (خصم GABAB) و 0-1 ميكرومتر GABA. للخارج التدريجي في بقع ملي : 140 الكولين كلوريد الصوديوم أو الكلور ، 0.3 بوكل ، 2 MgCl 2 ، 0.5 CaCl 2 ، 5 EGTA ، 10 TES الحموضة 7،2-7،4.
  3. خلية كاملة الجهد المشبك التسجيلات : الحل حمام : هي perfused شرائح (2 -- 3 مل / دقيقة) مع ACSF تحتوي على حمض kynurenic الآن أيضا (3 ملم) والأدوية الأخرى التي قد تكون هناك حاجة لتجارب معينة والحل يتضمن ماصة في ملي : 140 CSCL ، 1 CaCl 2 ، 3 EGTA ، 0.5 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 2 ملغ ATP ، 0.3 - GTP نا ، 5 QX - 314 بروميد ، و 10 درجة الحموضة من 7.25 TES مع CsOH.

4. تشكيل جيجا اوم (GΩ) الختم لتصحيح التجارب - المشبك :

وتعقد شرائح الدماغ الحصين (الشكل 1A) في الجزء السفلي من غرفة تسجيل بواسطة خيوط النايلون على سلك البلاتين على شكل حرف U. من أجل تصور تنظيم مثل الأنسجة CA1 و 3 ومنطقة التلفيف المسنن في قرن آمون شرائح أو خلايا بعينها ، وكنت في حاجة الى مجهر. معظم المختبرات استخدام المجهر تستقيم مع أهداف تتراوح بين 10X 60X وبالتالي السماح لاحد لتحديد المناطق أو خلايا محددة في الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن لشرائح التصحيح حتى يتم استخدام مجهر تشريح ثم يمكنك التعرف بصريا منطقة التصحيح ولكن ليس إلى خلية معينة. ويطلق على هذا النوع من التصحيح "الترقيع العمياء". أنان كلتا الحالتين واحدة في نهاية المطاف هو ترميم خلية واحدة في منطقة معينة. معدل النجاح هو مماثل للطريقتين. على الرغم من أن تنظيم الهيئات خلية من الخلايا الرئيسية في قرن آمون في الصفيحة منظم للغاية (على سبيل المثال CA3/CA1 الطبقة الهرمية وعلى النحو المحدد في نطاقات مشرق شريحة الدماغ الحصين) متناثرة بين جميع الفروع وطبقات الحصين هي أجسام الخلايا المثبطة لل interneurons التي تشكل حوالي 10 ٪ من مجموع سكان العصبية 12. ويمكن التفريق بين عصبون عرضية أو الدبقية التي قد تكون مصححة في الخلية الحبيبية أو الصفيحة العصبية الهرمية من الخلايا الرئيسية التي خصائص كهربائية مختلفة من هذه الخلايا (انظر كتاب الحصين 13).

  1. GΩ ختم التشكيل. خلال هذا الإجراء ماصة الزجاج يصبح نوعا ما تعلق بإحكام إلى الغشاء الخلوي والتصحيح في تكوينات مختلفة (انظر أدناه و 4 و 5) يمكننا قياس نشاط GABA تنشيط القنوات الموجودة في الغشاء الخلوي.
    وضع ماصة في حامل ماصة وإحكام الغطاء الذي تسمر في ماصة. الإعدادات على مكبر للصوت 200B Axoclamp هي : V - المشبك ، ربح 2 ، تصفية 2 كيلو هرتز ، واحتمال عقد 0 بالسيارات ونحن نقوم التجربة عن طريق الكمبيوتر باستخدام برنامج PClamp.
  2. ضربة في قطعة الفم التي تعلق على الانبوب الذي يربط لصاحب ماصة وإغلاق صمام بين قطعة الفم والأنبوب. وهذا يخلق ضغطا إيجابيا في ماصة الخاص. الضغط الإيجابي في ماصة مهمتان : أولا ، سوف تيار يخرج من ماصة وبمجرد أن يدخل ماصة الحل حمام أنها سوف تساعد حفظ غيض ماصة نظيفة. ثانيا ، تطبيق لطيف الامتصاص للغشاء الخلية من خلال ماصة - التصحيح هو جزء حيوي من تشكيل جودة عالية ، وذات مقاومة عالية الختم. ختم كثيرا ما يمكن تشكيلها ببساطة عن طريق فتح صمام الضغط الذي يتحكم في ماصة. وبسبب هذا ، تأكد من عدم وجود تسرب الهواء. يمكنك اختبار للكشف عن التسربات بسهولة عن طريق اتخاذ حامل مع ماصة ، وتراجع قبل ان تتحول الى دورق مملوء بالماء وضربة في قطعة الفم. إذا كنت ترى أي فقاعات الهروب ثم أن جزءا ليس ضيقا بما فيه الكفاية.
  3. أقل ماصة الخاص في حل الحمام. على شاشة الكمبيوتر حيث يمكنك قياس مقاومة ماصة سترى نبض مربع تم إنشاؤها بواسطة قطار 5 نبض بالسيارات وعدد تخبرك مقاومة ماصة الخاص. يمثل أكبر عدد أصغر الفتحات غيض ماصة ، وأكبر الماصات. ضبط ماصة الإزاحة إلى 0.
  4. ختم لغشاء الخلية. تحديد المنطقة أو الخلية أنت ذاهب إلى التصحيح ، وهذا هو ، على شكل خاتم. ضمن شريحة الدماغ يمكن للمرء التعرف على الحبيبية التلفيف المسنن أو CA1 وCA3 خلايا الجسم الهرمي مناطق حصين والعصابات مشرق (انظر الشكل 1A) باستخدام 10X التكبير على المجهر أو أن نتمكن من تحديد الخلايا العصبية الفردية السطح الهرمي باستخدام 60X التكبير.
    1. جلب ماصة الخاص إلى التركيز بحيث ترى كل من المنطقة الخاصة بك / وماصة للخلية عندما تنظر من خلال القطع العين المجهر.
    2. ضع ماصة فوق المتوسطة من الخلية المنطقة / تتلاعب به ضبط حركة الخشنة وأقل ماصة للغاية وهو ما يزيد قليلا ولكن ليس لمس الأنسجة.
    3. بلطف شديد أقل ماصة الخاص على منتصف منطقتكم / خلية باستخدام الإعدادات غرامة على الحركة وتتلاعب بك في نفس الوقت مشاهدة شاشة الكمبيوتر وتتبع للمقاومة ماصة الخاص. ماصة مواصلة التحرك لأسفل حتى ترى مقاومة ماصة تصبح أكبر (عدد أكبر).
    4. الآن ، وإطلاق سراح برفق الضغط الايجابي في ماصة عن طريق فتح صمام. هذه المبالغ لطيف الامتصاص وغالبا ما تكون أشكال جيغا الختم (ختم عالية المقاومة ، GΩ) automatically.If لا ، ثم تطبيق لشفط قطعة الفم حيث قمت بتطبيق الضغط الايجابي سابقا غيغا وختم النموذج من.
    5. كنت قد حصلت الآن على ما يسمى الخلوي المرفقة التصحيح ، المشبك التكوين (انظر الشكل 1B). ضبط السعة تعويض سريع وبطيء لإلغاء العابرين القادمين من ماصة وحامل ماصة. على شاشة الكمبيوتر سوف ترى الآن تتبع شقة الحالية. أعلى ختم GΩ القيمة ، وأفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء وسوف يكون لديك في تسجيلات قناة واحدة.

أحيانا يمكن أن يكون من المفيد أن التصحيح داخل شريحة الحصين. في بعض الحالات يمكن أن يكون أكثر صحة الخلايا عندما لا تكون على السطح كما هي المزيد من الحماية لها. ويمكن أيضا ، في حالة واحدة تدرس الآثار المترتبة على البيئة خارج الخلية على الوظائف الخلوية ، مثل تأثير تركيزات دينسي خارج الخلية على الجيل الحالي منشط في الخلايا العصبية ، التصحيح داخل الأنسجة تكون ميزة. إجراء التصحيح هو نفسه كما هو موضح أعلاه بصرف النظر عن أن واحدا لا حرر بوالضغط sitive في ماصة حتى غيض ماصة ضمن شريحة.

5. إنشاء تكوين خلية كاملة وتسجيل تيارات خلية كاملة :

  1. في تكوين الخلية المرفقة ، تغيير محتمل ماصة إلى -60 بالسيارات أو على مقربة من المحتمل الغشاء الخلوي يستريح.
  2. تطبيق الشفط إلى ماصة عبر أنبوب متصل إلى حامل ماصة ، وفي الوقت نفسه مشاهدة شاشة الكمبيوتر لاحظ التغيير في المقاومة والعابرين السعة التي تظهر مرة واحدة لديك كسر في الخلية. عندما يحدث هذا كنت في وضع ما يسمى خلية كاملة التكوين أو الجامع الخلوي (الشكل 1B).
    المقاومة غشاء الخلية يختلف من نوع إلى آخر ، والخلية يعتمد على تصرف للقنوات في الغشاء وكم مفتوحة. السعة غشاء الخلية يختلف مع حجم الخلية. وينبغي أن تكون البداية شفط بلطف ولكن إذا كان من الصعب اقتحام قوة أكثر من خلية يمكن تطبيقها. ويمكن أيضا نبضات من الشفط يمكن استخدامها.
  3. أحيانا لا بد من التعويض عن المقاومة التي تتطور بين الخلية وماصة. وهذا ما يسمى سلسلة أو المقاومة وصول (روبية أو رع) التعويض ويمكن أن يتم إما عن طريق البرامج أو يدويا باستخدام مفتاح التحكم في مكبر للصوت. في تجاربنا نحن لا تعوض را لكن يتم رفض التجارب إذا كان يختلف بأكثر من 25 ٪ من المقاومة الوصول الأولية.
  4. التيارات منشط GABA تنشيط سجلت في وضع كامل الخلية.

في تكوين خلية كاملة في الخلايا العصبية CA1 الحصين الهرمية وضعنا احتمال عقد في -- 60 فولت ، والانتظار لمدة 5 -- 10 دقائق يسمح الحل ماصة للتوازن مع الداخل الخلية. خلال هذا الوقت تسجيل يصبح مستقرا. خلال التجربة أن نبقي المسار من قيمة المقاومة السلسلة.

تتم التجارب في المشبك الجهد ويمكن قياس الحالي من خلال مجموعة من السكان من قنوات في غشاء خلية كاملة. يمكن للمرء أن يفرق بين GABA التي تنشط التيارات متشابك وextrasynaptic بحكم طبيعة طوري ومنشط للتيارات. ويمنع جميع المتناحرين SR95531 GABA والتيارات. انخفاض في الضغط الحالي يشير إلى مستوى من منشط GABA تنشيط الحالية في الخلايا العصبية.

ونحن مهتمون الحالي GABA تنشيط منشط التي تعتمد على GABA ، خارج الخلية المحيطة في شريحة ونحن عادة لا التصحيح الخلايا على السطح ولكن بدلا من ذلك ،. الخلايا داخل شريحة ناهضات والخصوم التي نستخدمها لتعدل GABA هي طبق القنوات في حل الحمام وتصل لخلايا داخل شريحة. معدل تدفق الحل في الغرفة التجريبية 2-3 مل / دقيقة.

6. تسجيل واحد قناة تيارات :

تتم التجارب في الخلية المرفقة ، وخارج داخل أو خارج التدريجي التكوين التصحيح ، المشبك (يرجى الاطلاع هنا أدناه) ، ونحن من خلال تيارات سجل جزيئات قناة واحدة ، وحيدة القناة التيارات. الإعدادات على 200B Axoclamp ، والخامس المشبك ، كسب 500 ، تصفية 2 أو 5 كيلو هرتز. مع برنامج PClamp نتحكم إمكانات ماصة ، تعيين معدل العينات البيانات على ما لا يقل عن 100 ميكرو ثانية وسجل التيارات. من أجل تقليل الضوضاء في التسجيلات على قناة واحدة هي إبقاء حجم من الحل حمام منخفضة بحيث يغطي فقط شريحة.

  1. GABA تنشيط قنوات في التكوين الخلوي المرفقة. عندما يكون لديك حصل على ختم GΩ على الغشاء كنت في وضع الخلية المرفقة ويمكنك تسجيل من القنوات الموجودة في الغشاء التصحيح المحاطة ماصة (انظر الشكل 1B). كما غابا لا يعبر غشاء الخلية ، يتم وضع GABA في حل ماصة لتنشيط قنوات في التصحيح. Extrasynaptic GABA تنشيط قنوات تنشيط مع الكمون تصل إلى بضع دقائق. إمكانات التصحيح = -- ماصة المحتملة في أي عندما قمت بتعيين PClamp المحتملة في -- 40 فولت ، وتسجل من قبل غشاء كما بالسيارات 40 استقطابها.
    ميزة تسجيل في وضع الخلية المرفقة هو أن القناة في بيئتها الأصلية وذلك في اتصال مع البروتينات داخل الخلايا الطبيعية والعوامل. يتم تحديد العيب هو ان كنت لا تعرف بالضبط ما في احتمال كنت مسجلا كما كنت لا تعرف الراحة المطلقة غشاء المحتملة والممكنة وعبر التصحيح من جانب كل من إمكانات واحتمالات ماصة يستريح غشاء الخلية.
  2. GABA تنشيط قنوات في التكوين من الداخل إلى الخارج. عندما تكون في وضع الخلية المرفقة رفع برفق ماصة الخاص ونقلها إلى الجانب ، وبعيدا عن الشريحة باستخدام الحركات الدقيقة للmicromanipulators. لديك الآن إلى التصحيح من الداخل إلى الخارج ، ويمكن أن تسجل في وضع من الداخل إلى الخارج.
    تسجيل من رقعة من الغشاء الذي هو محاطة ماصة الخاص بك (انظر الشكل 1B). كما هو الحال في وضع الخلية المرفقة لكوقد غابا في حل ماصة لتنشيط القنوات. ولكن ، يمكن تطبيق المخدرات التي تعبر طبقة ثنائية المادة الدهنية مثل البنزوديازيبينات والباربيتورات ، البروبوفول الموجودين في حل حمام لأنها سوف تكون قادرة على عبور الحدود الى ماصة وتعدل القنوات [14]. إمكانات التصحيح = -- ماصة المحتملة وبما أنه لا يوجد احتمال غشاء يستريح مضافين كما هو الحال في وضع الخلية المرفقة ، فإن احتمال التصحيح يساوي ماصة ، على سبيل المثال إذا قمت بتعيين المحتملة إمكانية عقد في PClamp إلى -40 بالسيارات ثم التصحيح المحتملة هو بالضبط 40 بالسيارات.
    الاستفادة من التكوين من الداخل إلى الخارج هو أن واحدة يمكن تطبيقها المخدرات أو الإنزيمات إلى السطح الغشاء الداخلي وفحص إذا ما أثر على خصائص القناة. قوة صنع التصحيح من الداخل إلى الخارج لا ينطبق على البيئة غشاء القناة جعل تشكيل هذا التكوين التصحيح وقع حالا يمكن أن تكون أكثر تعقيدا لطيف لقناة مما كانت عليه عندما يتم تشكيل خارج التصحيح التدريجي (انظر أدناه) .
  3. GABA تنشيط قنوات في تكوين خارج التدريجي. عندما تكون في وضع كامل الخلية رفع بلطف صعودا أو التراجع ماصة باستخدام حركات غرامة micromanipulator الخاص. في نفس الوقت مراقبة نافذة على جهاز الكمبيوتر الخاص بك الذي يعرض خصائص التصحيح. كما ترسمه ماصة بعيدا عن الخلية سترى العابرين السعة ، وسوف تختفي مرة أخرى ختم GΩ. وقد شكلت كنت الآن خارج التصحيح التدريجي ويمكن أن تسجل في وضع خارج التدريجي.
    بطريقة أو بأخرى في غشاء الخلية اغلقت خلال افتتاح غيض من ماصة ، داخل الغشاء الداخلي يواجه ماصة وخارج الأصلي من وجوه غشاء غرفة تسجيل (الشكل 1B). تذاب الآن GABA المخدرات وغيرها ، لدراستها في حل الحمام. إمكانات التصحيح = ماصة المحتملة مثلما في وضع مثل خلية كاملة إذا قمت بتعيين المحتملة عقد في PClamp إلى 40 ثم بالسيارات إمكانية التصحيح هو بالضبط 40 بالسيارات.
    مزايا وضع خارج التدريجي هو أن تعرف بالضبط ما هي قدراتك والغشاء الخارجي والغشاء الأصلي وجوه يمكن حل الغرفة التجريبية ، والمخدرات ، ليتم استخدامها في حل حمام وتطبيقها بسهولة على غسله والقنوات. مساوئ هي التي لم تعد قد تعلق على قناة البروتينات داخل الخلايا ، وحتى عبر الغشاء والعوامل التي قد تكون هناك حاجة لوظيفة القناة بالكامل كما كان الغشاء لختم الزائدة وربما يكون قد فقد بعض جزيئات تم أو البيئة المحلية المشوهة في الغشاء هذه العملية. ولكن ، إلى جانب التصحيح في تكوينات مختلفة تسمح تشريح خصائص القناة على المستوى الجزيئي الذي لا يمكن بأي طريقة أخرى اليوم.

7. تحليل النتائج :

ويتم تحليل التيارات على قناة واحدة وكلها الخلوي مع برنامج PClamp. لتحليل الأحداث متشابك نستخدم Synaptosoft (GA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو مسجل المحاور (سيدني ، أستراليا).

8. ممثل النتائج :

التين. 2A يظهر على قناة واحدة التيارات تفعيلها من خلال تركيز 20 نانومتر GABA في رقعة الخلية المرفقة في التلفيف المسنن العصبية الحبيبية. كان كمون تفعيل تصرف القناة أقصى 2 دقيقة و 38 ثانية وكان تصرف القصوى 44 PS 15. وكان التصحيح بنسبة 40 استقطابها بالسيارات. التين. 2B يبين المحاضر أمثلة الجهد المشبك كامل الخلية الحالية من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران identifiying منشط والتيارات طوري. وخصم GABAA SR95531 يمنع كلا من extrasynaptic - (منشط) ومتشابك ولدت (طورية) GABA التي تنشط التيارات. طبقنا خصم GABAA SR95531 (100 ميكرومتر) إلى (با) عصبون التلفيف المسنن و (ب ب) الانسولين تعامل الخلايا العصبية الهرمية CA1 الكشف عن منشط الحالية التي تحول في خط الأساس الحالية الناجمة عن SR95531 حجب القنوات extrasynaptic (با ، ب) و اختفاء التيارات متشابك عندما SR95531 كتل القنوات متشابك (BB). تحت ظروف العصبونات الهرمية CA1 القاعدية لم يكن لديك منشط GABA تنشيط التيارات 6 ولكن عندما تتعرض الخلايا العصبية لتركيزات الفسيولوجية للأنسولين 4 التيارات منشط GABA تنشيط النمو.

الشكل 1
الشكل 1A. الجرذ شريحة الدماغ الحصين ، والمناطق التي تم تحديدها هي CA1 وCA3 طبقات الخلايا الهرمية والتلفيف المسنن (ج) الطبقة الحبيبية الخلية. باء تخطيطي التصحيح ، المشبك تكوينات.

الشكل 2
الشكل 2A. الأحادية القناة التيارات تنشيط بنسبة 20 نانومتر GABA في رقعة الخلية المرفقة على التلفيف المسنن الخلايا الحبيبية في دماغ الفئران شريحة الحصين. وكان احتمال عقد استقطابها 40 بالسيارات (ماصة المحتملة = -40 فولت). النجمة (* ، 1 ش التتبع الحالية) ويحدد من حيث التيارات التي تظهر على مقياس أسرع وقت (2لقد التقطت الثانية تتبع الجارية) من. التيارات الجامعة خلايا باء المسجل في دماغ الفئران شريحة الحصين في التلفيف المسنن أ و ب الخلية الحبيبية الخلايا العصبية الهرمية CA1 الجهد في وضع المشبك في إمكانية عقد -60 بالسيارات. للتجارب CA1 ، وحضنت في الأنسولين شرائح 1 نانومتر لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل وسجلت التيارات.

Discussion

التيار خلية كاملة تمثل مجموعة متكاملة من التيارات التي تم إنشاؤها بواسطة القنوات النشطة في الخلية. وعلم الصيدلة والنفاذية كلوريد محددة من القنوات GABAA يجعل من الممكن تحديد التيارات المرتبطة بهذه القنوات. طبيعة عابرة لتفعيل قنوات متشابك وتنشيط منشط للقنوات extrasynaptic يسمح السهل التفريق بين هؤلاء السكان اثنين من قنوات GABAA أعرب في الخلايا العصبية. ومع ذلك ، لا يمكن إلا على قناة واحدة مع تسجيلات دراسة واحدة من الخصائص الحركية للجزيئات القناة التي تولد تيارات منشط. على عكس القنوات التي تنشط داخل متشابك 100 ميكرو ثانية ، يتم تنشيط قنوات GABAA منشط مع الكمون في نطاق دقائق من الوقت يتم تطبيق 4،7،15،16،17،18 GABA. لا يمكن تأجيل تفعيل هذه النتائج في تلك القنوات قناة خصائص كثيرة يمكن دراستها باستخدام خلية كاملة التسجيلات. ويمكن في مستوى واحد قناة يتم التعرف على مختلف المجموعات الفرعية من السكان من القنوات GABAA على أساس اختلاف الخصائص الفنية والدوائية. وهكذا ، عن طريق اتخاذ ما ميزة التصحيح المختلفة ، المشبك تكوينات لهذا العرض ، فمن الممكن للدراسة في التفاصيل الدالة الجزيئية وعلم الصيدلة من القنوات التي تنشط GABA التي تولد تيارات منشط ومتشابك في الخلايا العصبية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث السويدية ، وجامعة أوبسالا فريدريك وانغريد مؤسسة Thurings. عقدت ZJ زمالة ما بعد الدكتوراه من EXODIAB وSvenska Sällskapet لForskning Medicinsk. نشكر فرانك لي للحصول على المساعدة التقنية.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany)

Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pavlov, I., Savtchenko, L. P., Kullmann, D. M., Semyanov, A., Walker, M. C. Outwardly rectifying tonically active GABAA receptors in pyramidal cells modulate neuronal offset, not gain. J Neurosci. 29, 15341-15350 (2009).
  2. Chao, H. T., Chen, H., Samaco, R. C., Xue, M., Chahrour, M. Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes. Nature. 468, 263-269 (2010).
  3. Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468, 305-309 (2010).
  4. Jin, Z., Jin, Y., Mendu, K. M., Degerman, E., Groop, L., Birnir, B. Insulin reduces neuronal excitability by turning on GABA(A) channels that generate tonic current. Plos One. 6, e16188-e16188 (2011).
  5. Nusser, Z., Mody, I. Selective modulation of tonic and phasic inhibitions in dentate gyrus granule cells. J Neurophysiol. 87, 2624-2628 (2002).
  6. Semyanov, A., Walker, M. C., Kullmann, D. M. GABA uptake regulates cortical excitability via cell type-specific tonic inhibition. Nat Neurosci. 6, 484-490 (2003).
  7. Birnir, B., Korpi, E. R. The impact of sub-cellular location and intracellular neuronal proteins on properties of GABA(A) receptors. Curr Pharm Des. 13, 3169-3177 (2007).
  8. Olsen, R. W., Sieghart, W. International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function. Update. Pharmacol Rev. 60, 243-260 (2008).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  10. Sakmann, B., Neher, E. The Single-Channel Recording. 2 ed., Plenum Press. New York. (1995).
  11. Zilberter, Y., Zilberter, T., Bregestovski, P. Neuronal activity in vitro and the in vivo reality: the role of energy homeostasis. Trends Pharmacol Sci. 31, 394-401 (2010).
  12. Spruston, N., McBain, C. Structural and functional properties of hippocampal neurons. The Hippocampus Book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. Oxford University Press. Oxford. (2007).
  13. The Hippocampus Book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. Oxford University Press. Oxford. (2007).
  14. Eghbali, M., Curmi, J. P., Birnir, B., Gage, P. W. Hippocampal GABA(A) channel conductance increased by diazepam. Nature. 388, 71-75 (1997).
  15. Lindquist, C. E., Birnir, B. Graded response to GABA by native extrasynaptic GABA receptors. J Neurochem. 97, 1349-1356 (2006).
  16. Birnir, B., Eghbali, M., Cox, G. B., Gage, P. W. GABA concentration sets the conductance of delayed GABAA channels in outside-out patches from rat hippocampal neurons. J Membr Biol. 181, 171-183 (2001).
  17. Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., Gage, P. W. B. icuculline pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons. Br J Pharmacol. 131, 695-704 (2000).
  18. Birnir, B., Everitt, A. B., Gage, P. W. Characteristics of GABAA channels in rat dentate gyrus. J Membr Biol. 142, 93-102 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics