畸胎瘤代睾丸胶囊

Medicine
 

Summary

人类多能干细胞(hPSCs)有无数不同的疾病的潜在治疗。这些细胞的效用在于事实,即他们可以分化成人体任何细胞类型。在这里,我们描述畸胎瘤实验,这用于演示的hPSCs pluripotence的。

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Peterson, S. E., Tran, H. T., Garitaonandia, I., Han, S., Nickey, K. S., Leonardo, T., et al. Teratoma Generation in the Testis Capsule. J. Vis. Exp. (57), e3177, doi:10.3791/3177 (2011).

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Abstract

多能干细胞(PSCS)有独特的特点,他们可以分化成所有三个胚层的细胞。这使得他们为许多不同疾病的治疗具有潜在价值的工具。 (胚胎干细胞)与诱导多能干细胞(iPS细胞),并继续与人类胚胎干细胞研究的到来需要有一个实验可以证明,一个特定的细胞是多能干。生殖传输已经证明小鼠胚胎干细胞(MESC)线1,2,3 pluripotence的黄金标准。使用这个实验中,研究人员可以表明,卓制线可以使所有类型的细胞在胚胎生殖细胞4。随着一代人类ESC线5,6,相应的检测来证明这些细胞的pluripotence不清楚,因为人类胚胎干细胞不能为生殖传输测试。作为替代,畸胎瘤法是目前用来展示pluripotency人类多能干细胞(hPSCs)7,8,9。虽然此法最近受到审查,并正在积极探索新技术,畸胎瘤法是目前的黄金标准7。在这个实验中,细胞免疫受损小鼠注入。如果是多能干细胞,最终将发展畸胎瘤和肿瘤的部分,将显示所有3个胚层组织。在畸胎瘤检测,hPSCs可以被注入老鼠的不同领域。最常见的注射部位,包括睾丸胶囊,补肾胶囊,肝,或到腿部皮下或肌肉注射11。在这里,我们描述了一个强大的协议畸胎瘤的肿瘤生长的部位使用睾丸胶囊hPSCs代。

Protocol

注:所有动物的程序必须由IACUC或相当于批准。

所有手术设备,手术前必须经过消毒。必须使用无菌手套,窗帘和纱布。

1。手术前准备

  1. 获得6周大的小家鼠CbySmn.CB17-Prkdc SCID鼠/ J的雄性小鼠或其他免疫功能低下小鼠品系。
  2. 消毒所有的手术器械,手套和纱布。
  3. 游离hPSCs被与accutase注射。
  4. 计数细胞和悬浮1,000,000每20-30μL细胞基底膜稀释DMEM/F-12 1:1。细胞置于冰上,直到完成。
  5. 请注意,往往通过注射台盼蓝实验运行是有益的事情。这将有助于识别任何潜在的问题,在任何细胞都浪费掉了。
  6. 在饲养箱,麻醉你的鼠标,根据你的机构接受的程序。在我们的实验中,我们使用了麻醉ESIA机与异氟醚。小鼠最初被放置在一个感应室1L/min氧和3-4%的异氟醚。一旦麻醉,鼻锥与1L/min的氧气和2-3%的异氟醚。
  7. 剃光与快船队的腹部,并清理鼠标腹部前壁,从腹部的中心开始向外顺时针方向和工作。首次使用聚维酮碘溶液,然后用70%乙醇。重复3次,每次改变拭子。动物转移到一个加热垫,保持温暖的动物组织培养或解剖罩内。
  8. 使1厘米的纵向切口,通过皮肤与腹膜无菌手术剪刀,略低于髋关节水平。
  9. 腹膜,用镊子走向右臀达到另一个无菌forcept和白色脂肪组织连同附睾丸拉出。
  10. 睾丸放在无菌纱布。
  11. 补充结核菌素或哈密尔顿(1CC)注射器无线TH的hPSCs被注入。请注意,这是一个好主意,包括一个控制的HPSC行,你知道是WA09(也称为H9亚型),如多能干。这样,你有一个积极的控制,你可以用它来确定是否是有缺陷的注​​射或手术。
  12. 慢慢的hPSCs(20-30μL)注入睾丸胶囊中心远离任何大血管,停止,如果睾丸胶囊开始膨胀。
  13. 慢慢取下针,以避免回流的细胞。
  14. 使用镊子,转移到其原来的位置在腹部的睾丸和脂肪组织回。
  15. 关闭了2个或3个re​​absorbable缝合腹膜和皮肤与autoclips关闭。
  16. 鼠标应保持温暖,直到它恢复和手术后的一些镇痛药的形式(见什么是你的饲养箱中接受)一天两次1-2天。
    请注意,既不是麻醉剂,也不镇痛干扰与肿瘤的发展。
  17. 监测日é动物为6-12周的肿瘤生长。很少,肿瘤可能增长至6个星期前,注射后5毫米大小,因此它是重要的监测动物。如果发生这种情况,动物应安乐死和肿瘤处理和分析,像往常一样。
  18. 一旦肿瘤扪及达到约5毫米大小,麻醉鼠标,根据公认的动物协议的程序和牺牲。
  19. 取出肿瘤和文件 - 照片,测量尺寸,重量。
  20. 切成小块的肿瘤,并固定在4%多聚甲醛溶液。商店在4%多聚甲醛,直到样品被送到病理学家切片,染色和分析。

2。代表性成果:

当此协议的描述和注射的细胞是多能干,一个明显的,直观明显,肿瘤形成大多数在12个星期内。对于像WA09建立HPSC线,我们通常看到的6个星期内肿瘤。 IPSC的线,它是不寻常地看到8-10个星期内肿瘤。这是非常重要的,给老鼠注入了线,被称为是能干,作为阳性对照,以确保该程序是正确执行。肿瘤通常看起来非常庞杂,有许多附加囊肿(图1)。由病理学家的肿瘤样本分析显示分化组织所有三个胚层(图2)。

图1
图1。典型HPSC派生畸胎瘤在睾丸胶囊。

所描述的协议之后,一百万WA09细胞注入免疫受损小鼠的睾丸胶囊。六个星期后畸胎瘤进行了观察。一)的畸胎瘤拉鼠标。 b)关闭了畸胎瘤的图片。注意结构的异质性和囊肿。

图2 图2。苏木精和曙红染色切片从畸胎瘤显示每个胚层组织。
固定之后,畸胎瘤切片和苏木精伊红染色。由病理学家的分析显示,从每3个胚层细胞的存在。

Discussion

这里介绍的方法,提供一个高度可靠的,从在睾丸胶囊hPSCs产生畸胎瘤直截了当的方法。这项技术有几个关键参数。特别是,它是重要的注入HPSC细胞线,被称为是多能干细胞作为对照。其他重要参数包括注射液和肿瘤的观察之间的时间间隔。对于像WA09细胞株,畸胎瘤应观察6-8周。为IPSC的新线,我们发现,往往需要10个星期。另一个值得关注的是注入细胞的数量。我们注入一百万个细胞,但可以很容易地用较少的细胞进行检测。此外,注入介质是非常重要的。我们发现,我们得到最好的结果,当细胞被注入在基底膜和DMEM/F-12的1:1混合,PBS或DMEM/F-12反对。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这项工作是由摆围赠款#TR-1250,电阻RT1-01108,CL1-00502。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Invitrogen A1110501
DMEM/F-12 Invitrogen 113300-032
Matrigel BD Biosciences 354277

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References

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  11. Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).

Comments

1 Comment

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    One night, I waked up, and knell down against the window,
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    Reply
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