अति सक्रिय खमीर Ribosomes के chromatographic शोधन

Biology

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Summary

यूकेरियोटिक सह शुद्ध न्युक्लिअसिज़ और proteases द्वारा परंपरागत तरीके से शुद्ध ribosomes की तैयारी के संदूषण के बहाव के जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण पर नकारात्मक प्रभाव डालता है. एक तेजी से और सरल chromatographic शुद्धि की विधि के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर ribosomes का उपयोग कर इस समस्या को हल करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Meskauskas, A., Leshin, J. A., Dinman, J. D. Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes. J. Vis. Exp. (56), e3214, doi:10.3791/3214 (2011).

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Abstract

यूकेरियोटिक ribosomes अधिक अस्थिर कर रहे हैं के रूप में उनके eubacterial और archael समकक्षों की तुलना में, इस प्रकार शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत. विशेष रूप से तथ्य यह है कि कोशिकाओं के lysis proteases और न्युक्लिअसिज़ जो ribosomes नीचा कर सकते हैं की एक बड़ी संख्या विज्ञप्ति परेशानी है. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है इन एंजाइमों से ribosomes के रूप में जल्दी संभव के रूप में अलग. दुर्भाग्य से, परंपरागत अंतर ultracentrifugation तरीकों unacceptably समय की लंबी अवधि के लिए इन एंजाइमों को उजागर ribosomes पत्ते, उनकी संरचनात्मक अखंडता और कार्यक्षमता को प्रभावित है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, हम एक chromatographic चार्ज सिस्टीन Sulfolink राल का उपयोग विधि का उपयोग. यह सरल और तेजी से आवेदन काफी proteolytic सह शुद्ध और nucleolytic गतिविधियों, बरकरार है, अत्यधिक biochemically सक्रिय खमीर ribosomes की उच्च पैदावार उत्पादन कम कर देता है. हम सुझाव है कि इस विधि भी स्तनधारी ribosomes के लिए लागू किया जाना चाहिए. की सादगीविधि, और बढ़ाया और chromatographically शुद्ध ribosome की पवित्रता गतिविधि यूकेरियोटिक ribosomes के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी उन्नति का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. सिस्टीन की तैयारी Sulfolink राल का आरोप लगाया

  1. कमरे के तापमान पर Sulfolink राल (पियर्स) तैयार करें.
  2. Sulfolink युग्मन के रूप में दो 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक की शीशियों में निर्माता द्वारा आपूर्ति की जेल की एक 50% घोल का 10 मिलीलीटर की एक कुल 5 प्रत्येक शीशी में वितरित मिलीलीटर के साथ रखें.
  3. संक्षेप में 850 XG शीशियों अपकेंद्रित्र और ध्यान supernatants हटायें.
  4. युग्मन बफर में जेल में तीन बार 5 मिलीलीटर में resuspending मोती, 850 संक्षेप में centrifuging XG और विंदुक द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने से धो (50 मिमी Tris, पीएच 8.5, 5 मिमी EDTA).
  5. प्रत्येक ट्यूब युग्मन बफर में एक 50 मिमी एल सिस्टीन के समाधान के पांच मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 25 पर गारा मिश्रण डिग्री सेल्सियस
  6. अवशिष्ट धोने के रूप में 1.4 ऊपर कदम में वर्णित द्वारा एल सिस्टीन निकालें.
  7. बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर में जेल Resuspend [20 मिमी HEPES, पीएच 7.6, 5 मिमी मिलीग्राम (OAC) 2, 60 मिमी एनएच 4 सीएल, 2 मिमी डीटीटी], और बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर में धोने से राल संतुलित करना1.4 चरण में 3 बार के रूप में वर्णित है. एक 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र स्तंभ टोपी, और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस में निथारना राल आरएनए के लिए राल क्षमता बंधन ~ मिलीलीटर प्रति 260 इकाइयों 20 है.

2. एक सिस्टीन का उपयोग ribosomes chromatographic शुद्धि Sulfolink राल का आरोप लगाया

नोट: यदि एक तनाव है जहां protease गतिविधि के लिए एक मुद्दा हो साबित के साथ काम कर रहे, protease अवरोध कॉकटेल बाद के सभी बफ़र्स में इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. बर्फ पर सभी घटकों को बनाए रखने और सभी RNase मुफ्त पानी और बाँझ निस्पंदन का उपयोग समाधान तैयार.
  2. उपयुक्त मीडिया में - खमीर कोशिकाओं मध्य लॉग चरण (1.2 आयुध डिपो 595 = 0.6) के लिए रातोंरात हो जाओ . गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं, और बाध्यकारी और 3700 XG बफर अपकेंद्रित्र में 1 ग्राम कोशिकाओं 4 में 5 मिनट के लिए धो डिग्री सेल्सियस
  3. बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर में 2 मिलीलीटर की एक अनुमानित कुल मात्रा, और 0.5 मिमी ग्लास मनकों के एक बराबर मात्रा 4 से ठंडा का उपयोग बाधित Resuspend कोशिकाओं सी यू °गाना एक Biospec मिनी मनका डिब्बा (बार्टलेस्विल, ठीक है). नमूने कई ट्यूबों में विभाजित किया जा सकता है के रूप में की जरूरत है.
  4. एक के Beckman कल्टर ऑप्टिमा मैक्स ई ultracentrifuge (Fullerton, CA) में 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर centrifugation द्वारा अटूट कोशिकाओं, organelles, और सेलुलर मलबे निकालें.
  5. तत्काल का उपयोग करने से पहले, गोली +१००० पर एक मिनट के लिए राल के लिए भंडारण समाधान निकालने XG. राल के दो कक्षों की हर एक ग्राम मिलीलीटर के लिए प्रयोग किया जाता है.
  6. 30,000 XG स्पिन (S30) से सेल lysate supernatants निकालें, ध्यान लेने के लिए चार्ज Sulfolink घोल में सीधे या तो लिपिड अंश से बहुत ऊपर या ट्यूबों के नीचे सेल में मलबे में संदूषण, और जगह कम से कम. लिपिड परत को हटाने या pipet से बाहर धक्का के बाद टिप सतह पर तैरनेवाला में पार कर गया है द्वारा बचा जा सकता है.
  7. बर्फ पर 15 मिनट के लिए मिश्रण के बिना S30/Sulfolink मिश्रण सेते हैं.
  8. 15 मिलीलीटर की शंक्वाकार ट्यूबों में स्तंभ प्लेस और के लिए हज़ार XG पर अपकेंद्रित्रआर एक मिनट.
  9. कॉलम, हाथ से मिश्रण और बर्फ पर एक और 15 मिनट के लिए सेते में flowthrough भिन्न वापस प्लेस.
  10. 15 मिलीलीटर की शंक्वाकार ट्यूबों में स्तंभों प्लेस और एक मिनट के लिए हज़ार XG अपकेंद्रित्र. Flowthrough त्यागें.
  11. कैप स्तंभों और बाध्यकारी बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें. हाथ से स्तंभों का मिश्रण जब तक resuspended, कैप निकालने के लिए, और एक मिनट के लिए 1,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र. इस धोने प्रोटोकॉल दो बार दोहराएँ.
  12. प्रत्येक स्तंभ के लिए क्षालन बफर के 1.5 मिलीलीटर (20 ​​मिमी HEPES - KOH, 7.6 पीएच, 10 मिमी (OAC) मिलीग्राम 2, 500 मिमी KCl, 2mm डीटीटी, 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर हेपरिन) जोड़ें . हाथ से मिक्स slurries, और 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते
  13. नई 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर प्लेस स्तंभों. Eluate लीजिए. एक बार और अधिक इतना है कि अंतिम संयुक्त नमूना मात्रा ~ 3 मिलीलीटर क्षालन कदम दोहराएँ. खेतों में प्रयुक्त किए गए राल के बिना हेपरिन क्षालन बफर के साथ धोया जा सकता है और बाध्यकारी buffe के साथ संतुलन के बादr, और फिर से उपयोग बाद के लिए 4 पर बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर मात्रा ° सी में संग्रहीत.

3. Puromycin उपचार

नोट: एक वैकल्पिक विधि tRNA प्रजातियों contaminating हटायें ग्लूकोज समाप्त ribosome अपवाह को बढ़ावा देने के मीडिया अमीर ग्लूकोज से स्विच करने के लिए है. हालांकि, यह खमीर कोशिकाओं है, जो ribosome समारोह और एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है चयापचय स्थिति बदलने करता है.

आदेश में अंतर्जात peptidyl-tRNA, puromycin प्रदर्शन के साथ एक इलाज से ribosomes पट्टी.

  1. कमरे के तापमान पर 1M KOH dropwise जोड़कर पीएच 7.5 100 मिमी puromycin समाधान के लिए बेअसर.
  2. ~ 1mm अंतिम एकाग्रता eluate में निष्प्रभावी puromycin समाधान जोड़ें.
  3. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 100 मिमी GTP जोड़ें.
  4. 30 में 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस

4. Ribosomes के ग्लिसरॉल तकिये के माध्यम से अवसादन के द्वारा शुद्धीकरण

  1. प्लेस एक मिलीलीटर4 मिलीलीटर मात्रा polycarbonate ultracentrifuge एक ट्यूब में तकिया बफर (20 ​​मिमी HEPES, 7.6 पीएच, 10 मिमी (OAC) मिलीग्राम 2, 500 मिमी KCl, 2 मिमी डीटीटी, 25% ग्लिसरॉल).
  2. धीरे परत puromycin क्षालन भिन्न तकिया के शीर्ष पर, और 100.000 पर अपकेंद्रित्र के नमूने 4 बजे रात XG डिग्री सेल्सियस का इलाज
  3. अपकेंद्रित्र रोटर से ट्यूबों निकालें, और supernatants महाप्राण (व्यंजन).
  4. तकिया बफर के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार शुद्ध ribosomes युक्त छर्रों धो लें.
  5. कोमल एक गिलास छड़ी का उपयोग व्यवधान के द्वारा 100 तकिया बफर के μl में ribosomes Resuspend.
  6. विघटन के बाद, parafilm ट्यूबों के साथ कवर और एक घंटे के लिए एक ठंडे कमरे भंवर में एक मध्यम गति से हिला.
  7. Microcentrifuge ट्यूब, अधिकतम गति से 5 मिनट के लिए 4 में अपकेंद्रित्र ° सी, सामग्री स्थानांतरण और ताजा ट्यूबों supernatants हटायें.
  8. दोहराएँ कदम 4,1 4,7 भंडारण बफर की है कि 100 μl (50 मिमी HEPES KOH 7.6 पीएच, 50 मिमी एनएच 4 सीएल, 5 मिमी मिलीग्राम छोड़कर तकिया बफर के 2 मिलीग्राम और का उपयोग कर(OAC) 2, 1 मिमी डीटीटी, 25% ग्लिसरॉल) 4.4 तकिया बफर के बजाय कदम और 4.5 में प्रयोग किया जाता है.
  9. यों शुद्ध ribosomes spectrophotometrically (1 ए 260 = 20 pmoles खमीर ribosomes के), और -80 में दुकान डिग्री सेल्सियस खमीर के 1 ग्राम से ठेठ परिणाम ribosomes के 300-400 pmoles हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

शाही सेना प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख कदम के प्रत्येक से निकाले प्रजातियों में से एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. जबकि rRNAs प्रमुख प्रजातियों कुल सेल lysates में मौजूद (टी) ये भी अन्य आरएनए प्रजातियों में से एक बड़ी संख्या में होते हैं. Sulfolink स्तंभ (एसएल) से शुद्ध Ribosomes भी इन प्रजातियों के लिए स्तंभ बिस्तर के उच्च आत्मीयता के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए कारण tRNAs की एक बड़ी राशि शामिल है. Peptidyl - tRNAs से पेप्टाइड्स की hydrolysis में puromycin परिणामों के साथ इस अंश के उपचार, और ribosomes से इन प्रजातियों के पृथक्करण को बढ़ावा देता है. puromycin इलाज नमूने (PM) सह purifyin कमीछ tRNA प्रजातियों, और इस प्रकार पूरी तरह से शुद्ध ribosomes प्रतिनिधित्व करते हैं. जैसा कि पहले 8 सूचना दी, इन ribosomes अत्यधिक बरकरार है और biochemically सक्रिय हैं, उन्हें विस्तृत कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श substrates बना.

चित्रा 1
चित्रा 1. विधि फ़्लोचार्ट sulfolink राल लिंक्ड सिस्टीन का उपयोग ribosomes के chromatographic शुद्धि दिखाया गया है .

चित्रा 2
चित्रा 2. Ribosome तैयारी के प्रतिनिधि विश्लेषण कुल आरएनए प्रजातियों कुल सेल lysates (टी), Sulfolink शुद्ध ribosomes (एसएल) और Sulfolink शुद्ध ribosomes बाद puromycin साथ इलाज से निकाले गए थे और एक ग्लिसरॉल तकिया (प्रधानमंत्री) के माध्यम से sedimented. लेन एम आरएनए आकार मार्कर का प्रतिनिधित्व करता है. 25S 18s और rRNAs के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tRNAs और अन्य आरएनए प्रजातियों का प्रतिनिधित्व बैंड संकेत कर रहे हैं. सबगलियों शाही सेना के 2 μg के साथ भरी हुई थी.

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Discussion

Ribosome शुद्धि प्रोटोकॉल मूल रूप से lysing कोशिकाओं शामिल है, एक कम गति स्पिन से एक साइटोसोलिक अंश संचयन, और फिर उच्च गति 1 centrifugation द्वारा ribosomes pelleting. जबकि कुछ तरीकों उपन्यास बैक्टीरियल ribosomes सफ़ाई के लिए इस्तेमाल किया गया है, वही 2-4 eukaryotes के लिए सच नहीं किया गया था . हालांकि अतिरिक्त कदम के वर्षों में, जैसे नमक washes, और ग्लिसरॉल कुशन (जैसे 5 देखते हैं) के साथ जोड़ा गया है, खमीर ribosomes के जैव रासायनिक और संरचनात्मक अध्ययन उनके प्रवृत्ति द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान अंतर्जात अपमानजनक एंजाइमों द्वारा अपमानित हो, सबसे अधिक संभावना ultracentrifugation चरणों के दौरान जो ribosomes 6 एंजाइमों के इन वर्गों को उजागर कर रहे हैं के दौरान समय की लंबी अवधि के कारण .

प्रमुख पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ जुड़े समस्या ribosomes और proteases न्युक्लिअसिज़ के सह - शुद्धि है. उनके गिरावट में यह परिणाम के दौरानशुद्धिकरण प्रक्रिया, biochemically सक्रिय ribosomes की कम पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप. proteases और रोगजनक बैक्टीरिया के चिकित्सीय आइसोलेट्स में मौजूद न्युक्लिअसिज़ के उच्च स्तर ribosome Sulfolink राल 7 चार्ज सिस्टीन का उपयोग कर शुद्धि के लिए एक chromatographic विधि के विकास के लिए नेतृत्व किया. बैक्टीरियल ribosomes इस पद्धति का उपयोग करके अलग से व्युत्पन्न rRNAs और प्रोटीन गिरावट के बहुत निचले स्तर से पता चला है, और इतनी शुद्ध ribosomes काफी अधिक इरिथ्रोमाइसिन बाँध और प्रोटीन synthesize करने में सक्षम थे. Sulfolink राल ribosome बाध्यकारी के विशिष्ट रसायन विज्ञान अज्ञात है, लेकिन यह अनुमान लगाया गया है कि यह hydrophobic बातचीत शामिल है 7 . इन टिप्पणियों का सुझाव है कि सिस्टीन Sulfolink राल क्रोमैटोग्राफी विधि चार्ज भी खमीर ribosomes के लिए लागू किया जा सकता है, और अगर ऐसा है, कि इसे हल कर सकता समस्याओं के कई ऊपर वर्णित है. इस प्रकार हम बरकरार है, अत्यधिक सक्रिय खमीर ribo के अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलितSomes. स्तंभ chromatographic तेजी से और कुशलता purer में जिसके परिणामस्वरूप ribosomes, जो तराजू अच्छी तरह से 8 ribosomes की उच्च मात्रा के लिए बढ़ाया जैव रासायनिक और संरचनात्मक गुणों के साथ biochemically सक्रिय ribosome तैयारी से न्युक्लिअसिज़ और proteases contaminating का एक महत्वपूर्ण अंश की जुदाई में परिणाम तरीका. कोई महत्वपूर्ण मतभेद एक denaturing परंपरागत शुद्ध ribosomes और क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के माध्यम से शुद्ध उन के बीच प्रोटीन जेल पर देखा गया था, यह दर्शाता है कि इन ribosomes परंपरागत शुद्ध ribosomes के रूप में सभी एक ही ribosomal तत्वों होते.

प्रोटोकॉल में कुछ कदम है कि विशेष ध्यान देने की की आवश्यकता हैं. खमीर कोशिकाओं के विघटन के संबंध के साथ, एक सटीक 01:01 सेल निलंबन के ग्लास मनकों अनुपात (/ खंड खंड) महत्वपूर्ण है. आमतौर पर, कक्षों की ~ 80% 2 मिनट में बाधित कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात है, पर-व्यवधान सेल organelles से अपमानजनक एंजाइमों की रिहाई को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए.हालांकि Sulfolink स्तंभ से सीधे प्राप्त ribosomes लगभग पूरी तरह से protease और nuclease संदूषण से मुक्त होना दिखाया गया है, tRNA के इस अंश में उच्च स्तर का अवलोकन संकेत दिया कि 7,8 अच्छी तरह से राल के रूप में tRNA बांध. हमने पाया है कि tRNA प्रजातियों की उपस्थिति हस्तक्षेप के साथ बहाव के जैव रासायनिक assays ribosome / ligand बाध्यकारी, peptidyltransferase गतिविधि के assays और rRNA संरचनात्मक विश्लेषण जैसे. Puromycin chromatographically peptidyl - puromycin जो ribosomes से जारी है, के उत्पादन में पृथक ribosomes परिणाम के deacylated 10-14 tRNAs साथ साथ इलाज 9. अंतिम रातोंरात एक ग्लिसरॉल तकिया के माध्यम से नमूने के उच्च गति centrifugation ribosome नमूने से शेष मुक्त tRNAs को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि अलग सब यूनिटों के लिए आवश्यक हैं, वे एक उच्च नमक sucrose 15 ढाल के माध्यम से अवसादन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम Dinman प्रयोगशाला के सदस्यों एस्टन Belew, करेन जैक, शर्मिष्ठा Musalga, सेर्गेई Sulima, शिवानी रेड्डी, और उनकी मदद और इस परियोजना पर निवेश के लिए माइकल Rhodin सहित सभी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अहा 0630163N) से AM और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (5R01 GM058859-12) से JDD. जल एक अमेरिकी पुनर्निवेश और वसूली अधिनियम 2009 के पूरक के मूल अनुदान के लिए (3R01GM058859-11S1) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfolink Coupling resin Pierce, Thermo Scientific 20402
Mini bead-beater 16 Biospec Products 607
Optima Max E ultracentrifuge Beckman Coulter Inc.
Legend RT Sorvall, Thermo Scientific
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Sigma-Aldrich 252859
EDTA Sigma-Aldrich E9884
DTT Sigma-Aldrich 43815
HEPES Sigma-Aldrich 54459
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
KCl Sigma-Aldrich 60128
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661
KOH Sigma-Aldrich 221473
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Puromycin Sigma-Aldrich P7255
GTP Fermentas R0461

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References

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Comments

2 Comments

  1. Could you please add the following two products to the material list, or provide the details here so I can repeat the protocol without guessing what you precisely used:

    L-cysteine
    heparin

    Reply
    Posted by: Kim v.
    March 31, 2013 - 8:43 PM
  2. L-cysteine: Acros Organics Cat. #173600²50;
    heparin: Sigma Cat. #H4784.

    Reply
    Posted by: Arturas M.
    April 4, 2013 - 10:49 AM

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